ラットの運動皮質におけるレーザー誘発脳損傷

Summary

ここで示すプロトコルは、脳損傷のげっ歯類モデルを作成する技術を示しています。ここで説明する方法は、レーザー照射を使用し、運動皮質を標的とする。

Abstract

実験的なげっ歯類モデルで脳卒中を誘導するための一般的な技術は、カテーテルを使用して中大脳動脈(MCAO-p)の過渡性(しばしばMCAO-tと呼ばれる)または永久的な(MCAO-pと呼ばれる)閉塞を含む。しかし、この一般的に受け入れられている手法には、いくつかの制限があり、それによってその広範な使用が制限されます。この方法による脳卒中誘導は、虚血領域の局在化および大きさの変動性の高さ、出血の周期的発生、および高い死亡率によって特徴づけられる。また、一時的または永続的な手順のいずれかを正常に完了するには、専門知識が必要であり、多くの場合、約30分間続きます。このプロトコルでは、げっ歯類モデルにおける脳損傷を誘発し、研究するための代替方法として役立つレーザー照射技術が提示される。

対照群およびMCAO群のラットと比較した場合、レーザー誘導による脳損傷は体温、梗塞容積、脳浮腫、頭蓋内出血、および死亡率の変動を減少させた。さらに、レーザーによる傷害の使用は、運動皮質と線条体組織の両方の破壊が観察されるMCAO実験とは異なり、運動皮質でのみ脳組織に損傷を与えた。

この調査結果から、レーザー照射は、運動皮質の脳損傷を誘発するための代替的かつ効果的な技術として役立つ可能性があることを示唆している。このメソッドは、プロシージャを完了する時間を短縮し、専門家のハンドラーを必要としません。

Introduction

世界的に、脳卒中は第2の主要な死因であり、障害の第3位の原因^である。脳卒中はまた、重度の障害につながり、多くの場合、医療スタッフや親戚からの余分なケアを必要とします。したがって、障害に関連する合併症を理解し、より肯定的な結果の可能性を改善する必要があります。

動物モデルの使用は、病気を理解するための最初のステップです。最良の研究成果を得るために、一般的なモデルには、単純な手法、手頃な価格、高い再現性、および最小限の変動性が含まれます。虚血性脳卒中モデルにおける決定因子としては、脳浮腫容積、梗塞サイズ、血液脳関門(BBB)の破壊の程度、および神経学的重症度スコア²を介して一般的に評価される機能障害が含まれる。

げっ歯類モデルで最も広く使用されている脳卒中誘導技術は、中大脳動脈(MCA)を一過性または永久的に^{閉塞させる3}.この技術は、ヒトのものと同様のストロークモデルを生成する:それは、ストローク領域を囲む陰茎を有し、高度に再現性があり、虚血持続時間および再灌流⁴を調節する。それにもかかわらず、MCAO法には若干の合併症がある。この技術は、多くの場合、追加の結果につながる視覚皮質および一般的な温熱の機能不全を伴う頭蓋内出血およびipsi側性の腎不全への傷害を起こしやすい^{55、6、7。6,7}他の制限には、誘発された脳卒中の高い変動(虚血の可能性のある拡張から、外部頸動脈領域のような意図しない領域に起因する)、MCAの閉塞が不十分、および早期再灌流が含まれる。また、異なる株や大きさのラットは、様々な梗塞容^積8を示す。前述のすべての欠点に加えて、MCAOモデルは、カテーテル法のための最小血管サイズの要件の点で技術的に限られているため、深部脳領域で小さな単離されたストロークを誘導することはできません。これにより、代替モデルの必要性がますます重要になります。別の方法、フォトトロンボシスは、MCAO手順に代わる可能性があるが、効率⁹を改善しない。このテクニックは、光でストロークをターゲットにし、以前のモデルでいくつかの改善を提供します。しかし、光血栓症は、二次的な併発に関連する侵襲的な頭蓋切り出しを必要とする^。

ここで示す欠点の観点から、ここで提示されるプロトコルはげっ歯類の脳損傷を誘発するための可能な代替レーザー技術を提供する。レーザー技術の作用機序は、生体組織に与えるレーザーの光熱効果に基づいており、身体組織による光ビームの吸収と熱への変換につながります。レーザー技術を使用する利点は、その安全性と操作の容易さです。レーザーが出血を止めるために熱を生成する能力は医学において非常に重要であり、与えられた満点で異なるビームを増幅する能力は、レーザーが目標点¹⁰の邪魔になる健康な組織を破壊することを避けることを保証する。このプロトコルで使用されるレーザービームは、そのエネルギーを放出したり、破壊を引き起こすことなく、骨などの低液体媒体を通過することができます。脳組織などの高い液体培地に到達すると、エネルギーを使って標的組織を破壊します。したがって、この技術は、脳の適切な領域でのみ脳損傷を誘発することができる。

ここで提示された技術は、照射のレベルを調節する能力の膨大な量を示し、最初から意図された脳損傷の選択されたバリエーションを生み出した。皮質と線条体の両方に影響を与える元のMCAOとは異なり、レーザー技術は脳損傷の影響を調節することができ、意図した運動皮質にのみ傷害を誘発した。本明細書において、レーザー誘発性脳損傷プロトコルおよびラットの大脳皮質に対して行われる処置の代表的な結果の概要が提供される。

Protocol

以下の手順は、欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われました。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました. 1. 動物の選択と準備 この処置のための異常な病理学なしで300から350 gの重量を量る65の雄のスプレイグ・ドーリーのラットを選ぶ。サイズが小さいほど、MCAO の手順に技術的な問題が生じ?…

Representative Results

制御または実験群のいずれにも死亡またはSAHが登録されなかった(表1)。MCAOグループは死亡率とSAHの両方の20%の割合を有していた。 両群のラットにおける相対体温変化も同様であったが、両群のばらつきの違いにもかかわらず(表1)。 レーザー(16 ±1.1)とMCAO(20±1.5)モデルの両方で、シャム操作対照群(1±0.3)と比較して有意に悪い…

Discussion

レーザー群で死亡またはSAHが発生しなかった場合、レーザー技術は最小限の侵襲性であると考えるのは公正です。死亡の主な原因とSAHは、元のMCAO技術¹⁰に示すように、頭蓋内圧(ICP)の上昇につながる血管への損傷である。レーザー群における死およびSAHの欠如は、レーザーの特定の効果による可能性が高い:彼らは血管に直接影響を与えないし、漏出の場合に凝固を誘発する?…

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA – ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA – ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA – ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA – ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA – ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA – ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA – ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA – ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA – ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA – ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA – ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA – ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620