Laser-inducerad hjärnskada i motor cortex av råttor
Summary
Protokollet som presenteras här visar en teknik för att skapa en gnagare modell av hjärnskada. Den metod som beskrivs här använder laser bestrålning och mål motor cortex.
Abstract
En vanlig teknik för att inducera stroke i experimentella gnagare modeller innebär den övergående (ofta betecknas som MCAO-t) eller permanent (betecknas som MCAO-p) ocklusion av den mellersta cerebral artär (MCA) med hjälp av en kateter. Denna allmänt accepterade teknik har dock vissa begränsningar, och begränsar därmed dess omfattande användning. Stroke induktion av denna metod kännetecknas ofta av hög variation i lokalisering och storlek av det ischemiska området, periodiska förekomster av blödning, och höga dödstal. Också, den framgångsrika slutförandet av någon av de övergående eller permanenta förfaranden kräver expertis och ofta varar i ca 30 minuter. I detta protokoll presenteras en laserbestrålningsteknik som kan tjäna som en alternativ metod för att inducera och studera hjärnskada i gnagaremodeller.
När jämfört med råttor i kontroll och MCAO grupper, hjärnan skada genom laserinduktion visade minskad variabilitet i kroppstemperatur, infarct volym, hjärnan ödem, intrakraniell blödning, och dödlighet. Vidare orsakade användningen av en laser-inducerad skada skador på hjärnvävnaderna endast i motor cortex till skillnad från i MCAO experiment där förstörelse av både motor cortex och striatal vävnader observeras.
Resultaten från denna undersökning tyder på att laser bestrålning skulle kunna fungera som en alternativ och effektiv teknik för att inducera hjärnan skada i motor cortex. Metoden förkortar också tiden för att slutföra proceduren och kräver inte experthanterare.
Introduction
Globalt är stroke den näst vanligaste dödsorsaken och den tredje vanligaste orsaken till funktionshinder1. Stroke leder också till svår funktionsnedsättning, ofta kräver extra vård från medicinsk personal och släktingar. Det finns därför ett behov av att förstå de komplikationer som är förknippade med sjukdomen och förbättra risken för mer positiva resultat.
Användningen av djurmodeller är det första steget för att förstå sjukdomar. För att säkerställa bästa forskningsresultat, en typisk modell skulle innehålla en enkel teknik, överkomliga priser, hög reproducerbarhet, och minimal variation. De avgörande faktorerna i ischemisk stroke modeller inkluderar hjärnan ödem volym, infarct storlek, omfattningen av blod – hjärnbarriären (BBB) uppdelning, och funktionsförsämring allmänt utvärderas via neurologisk svårighetsgrad poäng2.
Den mest använda stroke induktionstekniken i gnagare modeller occludes den mellersta cerebrala artären (MCA) transiently eller permanent3. Denna teknik ger ett slag modell som liknar de hos människor: det har en penumbra som omger linjerade området, är mycket reproducerbara, och reglerar ischemi varaktighet och reperfusion4. Icke desto mindre har MCAO-metoden vissa komplikationer. Tekniken är benägen att intrakraniell blödning och skada på ipsilateral näthinnan med en dysfunktion av den visuella cortex och gemensamma hypertermi som ofta leder till ytterligare resultat5,6,7. Andra begränsningar inkluderar höga variationer i inducerad stroke (som härrör från den troliga förlängningen av ischemi till oavsiktliga regioner, som den yttre halspulsådern regionen), otillräcklig ocklusion av MCA, och för tidig reperfusion. Också, råttor av olika stammar och storlekar uppvisar olika infarct volymer8. Förutom alla de nämnda nackdelarna, kan MCAO-modellen inte framkalla små isolerade stroke i djupa hjärnområden, eftersom det är begränsat tekniskt när det gäller dess krav på minsta kärlstorlek för kateterisering. Detta gör behovet av en alternativ modell desto mer kritiskt. En annan metod, photothrombosis, ger ett möjligt alternativ till MCAO förfaranden men inte förbättra på effektiviteten9. Denna teknik riktar stroke med ljus och erbjuder vissa förbättringar på de tidigare modellerna. Emellertid kräver photothrombosis en invasiv craniotomy som är associerad med sekundära compications9.
Mot bakgrund av skisserade brister ger det protokoll som presenteras här en kapabel alternativ laserteknik för att inducera hjärnskada hos gnagare. Laserteknikens verkningsmekanism bygger på laserns fototermiska effekter som förmedlas på levande vävnader, vilket leder till att ljusstrålarna upptags upptag av kroppsvävnader och att de förvandlingen till värme. Fördelarna med att använda en laserteknik är dess säkerhet och enkel manipulation. En laser förmåga att producera värme för att stoppa blödning gör det mycket viktigt inom medicinen, medan dess förmåga att förstärka olika strålar vid en given meet point säkerställer att lasrar undvika att förstöra friska vävnader som står i vägen för målet punkt10. Laserstrålen som används i detta protokoll kan passera genom ett låg flytande medium, såsom ben, utan att avge sin energi och / eller orsakar någon förstörelse. När den når ett högt flytande medium, såsom hjärnvävnader, den använder upp sin energi för att förstöra målet vävnader. Tekniken, därför, kan framkalla hjärnskada endast i lämpligt område i hjärnan.
Tekniken presenteras här visade en enorm mängd förmåga att reglera sina nivåer av bestrålning, producerar de valda variationerna av hjärnskada avsedd från början. Till skillnad från den ursprungliga MCAO som påverkar både cortex och striatum, lasertekniken kunde reglera effekterna av hjärnskada, inducera skada endast på den avsedda motor cortex. Häri tillhandahålls laser-inducerad hjärnan skada protokollet och en sammanfattning av representativa resultat för förfarandet utförs på hjärnbarken hos råttor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är rimligt att anta att lasertekniken är minimalt invasiv, med tanke på att inga dödsfall eller SAH inträffade i lasergruppen. Den primära dödsorsaken och SAH är den skada på blodkärl som leder till en förhöjning av intrakraniellt tryck (ICP), som visas i de ursprungliga MCAO-teknikerna10. Frånvaron av dödsfall och SAH i lasergruppen beror sannolikt på de särskilda effekterna av lasrar: de har inte direkt påverkan på blodkärlen och kan framkalla koagulation vid läckage. Lå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Institutionen för anestesiologi av Soroka University Medical Center och laboratoriet personal Ben-Gurion University of the Negev för deras hjälp i utförandet av detta experiment.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA – ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | SIGMA – ALDRICH | 76-03-9 | |
| Brain & Tissue Matrices | SIGMA – ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604E+11 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | SIGMA – ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | SIGMA – ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA – ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA – ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | SIGMA – ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf Tube | SIGMA – ALDRICH | EP0030119460 | |
| Ethanol 96 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| Evans Blue 2% | SIGMA – ALDRICH | 314-13-6 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | model Infinite 200 PRO multimode reader | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Infusion Cuff | ABN | IC-500 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| Multiset | TEVA MEDICAL | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | |
| Petri dishes | SIGMA – ALDRICH | P5606 | |
| Scalpel blades 11 | SIGMA – ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine | Laser Industries Ltd | ||
| Stereotaxic head holder | KOPF | 900LS | |
| Sterile Syringe 2 ml | Braun | 4606027V | |
| Syringe-needle 27 G | Braun | 305620 |
References
- World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
- Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
- Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
- Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
- Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
- Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
- Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
