Observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón
Summary
En este experimento, un ratón se inyecta en su vena trasera con isoticianato-dextrano Rhodamine B que puede manchar los vasos sanguíneos. Después de que el hígado está expuesto y fijo, una parte específica del hígado se puede seleccionar para observar el tejido profundo en el cuerpo vivo utilizando microscopía multifotónica.
Abstract
Observar la dinámica intravascular del tejido hepático del ratón nos permite realizar observaciones y estudios más profundos sobre las enfermedades relacionadas con los tejidos del hígado del ratón. Un ratón se inyecta con un tinte que puede manchar los vasos sanguíneos. Para observar el hígado del ratón in vivo, se expone y fija en un marco. Las imágenes bidimensionales y tridimensionales de los vasos sanguíneos del tejido hepático se obtienen utilizando un microscopio multifotófonos. Las imágenes de los tejidos en los sitios seleccionados se adquieren continuamente para observar cambios a largo plazo; también se observan los cambios dinámicos de los vasos sanguíneos en los tejidos hepáticos. La microscopía multifotónica es un método para observar la función celular y celular en secciones u órganos de tejido profundo. La microscopía multifotónica tiene sensibilidad a la microestructura tisular y permite la toma de imágenes de tejidos biológicos a alta resolución espacial in vivo, proporcionando la capacidad de capturar la información bioquímica de la organización. Microscopía multifoto se utiliza para observar parte del hígado, pero arreglar el hígado para hacer la imagen más estable es problemático. En este experimento, se utiliza una ventosa de vacío especial para arreglar el hígado y obtener una imagen más estable del hígado bajo el microscopio. Además, este método se puede utilizar para observar cambios dinámicos de sustancias específicas en el hígado marcando tales sustancias con colorantes.
Introduction
Los vasos sanguíneos pueden proporcionar nutrientes para varios tejidos de órganos del cuerpo humano, e intercambiar sustancias. Al mismo tiempo, muchas citoquinas, hormonas, medicamentos y células también funcionan a través del transporte vascular a lugares específicos. Observar los cambios vasculares en el tejido hepático puede ayudar a entender la distribución del flujo sanguíneo en el tejido hepático y el transporte de sustancias, y ayudar en el análisis de ciertas enfermedades relacionadas con la vascular1,2.
Hay muchas maneras de observar los vasos sanguíneos del hígado en ratones. Entre ellos, la microscopía óptica tiene muchas limitaciones en la observación del tejido vascular opaco3. Microscopía multifotónica se puede utilizar para imagen de los vasos sanguíneos de hígados vivos con alta resolución no invasiva4. No sólo se pueden obtener imágenes tridimensionales de los vasos sanguíneos, sino que la técnica también se puede utilizar para ayudar a organizar el tejido para observar los efectos biológicos en los mismo; además, todo el tejido se puede imaginar en lugar de sólo los microvessels como en la tomografía computarizada y la resonancia magnética5.
Microscopía multifotónica se puede utilizar para detectar eficazmente señales fluorescentes dispersas en tejido vivo profundo, con menos fototoxicidad6. Por lo tanto, la actividad del tejido vivo se puede asegurar, y la cantidad de daño se puede reducir. La microscopía multifotónica tiene mejor potencia penetrante que la microscopía confocal, lo que permite observar capas más profundas7,proporcionando imágenes 3D únicas. La microscopía multifotónica se utiliza ahora a menudo en los nervios craneales por imágenes8 y se ha extendido al estudio de la dinámica neuronal en ratones vivos9,10,11.
En este experimento, después del etiquetado fluorescente de los vasos sanguíneos de ratón, el hígado se fija en un marco, y la dinámica de los vasos sanguíneos en el tejido hepático vivo se puede ver utilizando microscopía multifotónica. Este experimento demuestra cómo marcar sustancias específicas, utilizar microscopía multifotónica para ayudar a observar una ubicación dentro del tejido, observar eventos celulares en el tejido intercelular, hacer mediciones fotoquímicas12,13,14,y observar la dinámica del material dentro del tejido vivo15. Por ejemplo, el marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) ha sido identificado como un nuevo marcador de superficie regulado en los vasos sanguíneos y el estroma en muchos tumores sólidos, marcando el fragmento variable de una sola cadena (scFv) 78 contra TEM1, y luego la microscopía multifotona se puede utilizar para la localización y evaluación del hemangioma del ratón16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Observar un tejido vivo específico es un medio eficaz para comprender los cambios, la localización y los efectos biológicos del material dentro del tejido17. En este experimento, los pasos importantes son la fijación del hígado con un accesorio de imágenes de órganos, que puede resolver el problema de los artefactos de movimiento debido a la respiración y los latidos del corazón, y el uso de un microscopio multifotófonos para la observación. Utilizando este método, los tejidos internos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772133, 81902444), el Fondo de Ciencias Naturales de Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), el Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología de la Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034, 201903010072) y el Proyecto militar de innovación médica (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
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