Fleksibel vinklet stereotaktisk tilgang til alsidige neurovidenskabsteknikker

Summary

Beskrevet her er en stereotaktisk procedure, der kan målrette udfordrende og vanskelige at nå hjernen regioner (på grund af rumlige begrænsninger) ved hjælp af en vinklet koronar tilgang. Denne protokol kan tilpasses både muse- og rottemodeller og kan anvendes på forskellige neurovidenskabelige applikationer, herunder kanyleimplantatering og mikroinjektioner af virale konstruktioner.

Abstract

Stereotaktisk kirurgi er et vigtigt redskab i det moderne neurovidenskabslaboratorium. Men evnen til præcist og præcist at målrette vanskelige at nå hjernen regioner stadig udgør en udfordring, især når rettet mod hjernen strukturer langs midterlinjen. Disse udfordringer omfatter undgå af den overlegne sagittal sinus og tredje ventrikel og evnen til konsekvent at målrette selektive og diskrete hjernekerner. Derudover er mere avancerede neurovidenskabsteknikker (f.eks. optogenetik, fiberfotometri og to-fotonbilleddannelse) afhængige af målrettet implantation af betydelig hardware til hjernen, og rumlige begrænsninger er en almindelig hindring. Præsenteret her er en modificerbar protokol for stereotaktisk målretning af gnaver hjernestrukturer ved hjælp af en vinklet koronar tilgang. Det kan tilpasses til 1) mus eller rotte modeller, 2) forskellige neurovidenskab teknikker, og 3) flere hjerneområder. Som et repræsentativt eksempel omfatter det beregning af stereotaktiske koordinater til målretning af musens hypothalamus ventromediale kerne (VMN) for et optogenetisk hæmningseksperiment. Denne procedure begynder med den bilaterale mikroinjektion af en adeno-associeret virus (AAV), der kodning af en lysfølsom chloridkanal (SwiChR++) til en cre-afhængig musemodel efterfulgt af den vinklede bilaterale implantation af fiberoptiske kanyler. Ved hjælp af denne tilgang viser resultaterne, at aktivering af en delmængde af VMN-neuroner er nødvendig for intakte glukosetællerresponser på insulininduceret hypoglykæmi.

Introduction

Neural kontrol af adfærd, fodring og metabolisme indebærer koordinering af meget komplekse, integrative og overflødige neurokredsløb. Et drivende mål for neurovidenskab feltet er at dissekere forholdet mellem neuronal kredsløb struktur og funktion. Selvom klassiske neurovidenskabsværktøjer (dvs. læsionering, lokale farmakologiske injektioner og elektrisk stimulering) har afdækket vital viden om den rolle, som specifikke hjerneregioner, der styrer adfærd og metabolisme, er disse værktøjer begrænset af deres mangel på specificitet og reversibilitet¹.

Nylige fremskridt inden for neurovidenskab område har i høj grad forbedret evnen til at afhøre og manipulere kredsløb funktion i en celle-type specifik måde med høj spatiotemporal opløsning. Optogenetiske^2- og chemogenetiske^3-tilgange tillader f.eks. hurtig og reversibel manipulation af aktivitet hos genetisk definerede celletyper af frit bevægende dyr. Optogenetik indebærer brug af lysfølsomme ionkanaler, såkaldte channelrhodopsiner, til at kontrollere neuronal aktivitet. Nøglen til denne teknik er genlevering af channelrhodopsin og en lyskilde til at aktivere opsin. En fælles strategi for genlevering er gennem en kombination af 1) genetisk manipulerede mus, der udtrykker Cre-rekombininer i diskrete neuroner, og 2) Cre-afhængige virale vektorer, der kodning channelrhodopsin.

Mens optogenetik giver en elegant, meget præcis måde at kontrollere neuronal aktivitet, metoden er betinget af vellykket stereotaktisk mikroinjection af den virale vektor og fiberoptisk placering i en defineret hjerneregion. Selvom stereotaktiske procedurer er almindelige inden for det moderne neurovidenskabslaboratorium (og der er flere fremragende protokoller, der beskriver denne procedure)^4,5,6, at være i stand til konsekvent og reproducerativt at målrette diskrete hjerneområder langs midterlinjen (dvs. den mediobasale hypothalamus, et hjerneområde, der er afgørende for reguleringen af homøostatiske funktioner⁷) præsenterer yderligere udfordringer. Disse udfordringer omfatter undgåelse af den overlegne sagittal sinus, tredje ventrikel, og tilstødende hypothalamus kerner. Derudover er der betydelige rumlige begrænsninger for den bilaterale implantation af hardware, der er nødvendig for hæmningsundersøgelser. Med disse udfordringer i tankerne, denne protokol heri præsenterer en modificerbar procedure for målretning diskrete hjerne regioner via en vinklet stereotaktisk tilgang.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt i overensstemmelse med National Institutes of Health, vejledningen for pleje og brug af dyr og blev godkendt af både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Environmental Health and Safety ved University of Washington. 1. Beregning af vinklede koordinater Ved hjælp af en koronar hjerne atlas, markere en ret trekant, således at hypotenus passerer gennem målet region af interesse. I det repræsentative eksempel (Figu…

Representative Results

Denne protokol beskriver en kirurgisk procedure for udførelse af optogenetiske undersøgelser for at afhøre den rolle, hypothalamus VMN neuroner i glykæmisk kontrol9. Først udnyttet var en standard (ikke-vinklet) stereotaktisk tilgang til bilateral mikroinjektion af en hæmmende channelrhodopsin virus til VMN. Mens en vinklet tilgang også ville være egnet, standard (ikke-vinklet) tilgang blev valgt, fordi det er tilstrækkeligt at målrette hjernen region af interesse og er en nem, pålideli…

Discussion

Nylige fremskridt inden for neurovidenskab har understøttet avanceret indsigt og forståelse i aktiviteten og funktionen af hjerne neurokredsløb. Dette omfatter anvendelse af optogenetiske og kemiske teknologier til at aktivere eller lukke munden diskrete neuronale populationer og deres projektion sites in vivo. På det seneste har dette omfattet udvikling af genetisk kodede calciumindikatorer (f.eks. GCaMP, RCaMP) og andre fluorometriske biosensorer (f.eks. dopamin, noradrenalin) til in vivo-registrering af neuronal a…

Materials

Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	—
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill