多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ
Summary
ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。
Abstract
定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。
Introduction
行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される。
近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学2 および化学遺伝学的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。
光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域7)は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)がF31-DK-113673(C.L.F.)、T32-GM-095421(C.L.F.)、DK-089056(C.L.F.)を助成金で支えました(.M 米国糖尿病学会革新的基礎科学賞(#1-19-IBS-192からG.J.M)、NIDDK出資の栄養肥満研究センター(DK-035816)、糖尿病研究センター(DK-017047)、糖尿病、 肥満と代謝トレーニンググラントT32 DK0007247(T.H.M)ワシントン大学で。
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
