Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia
Summary
Aquí se describe un procedimiento estereotáctico que puede apuntar a regiones cerebrales desafiantes y difíciles de alcanzar (debido a limitaciones espaciales) utilizando un enfoque coronal en ángulo. Este protocolo es adaptable tanto a modelos de ratón como de rata y se puede aplicar a diversas aplicaciones neurocientíficas, incluida la implantación de cánulas y microinyecciones de construcciones virales.
Abstract
La cirugía estereotáctica es una herramienta esencial en el laboratorio de neurociencia moderno. Sin embargo, la capacidad de apuntar con precisión y precisión a regiones cerebrales difíciles de alcanzar todavía presenta un desafío, particularmente cuando se dirigen a estructuras cerebrales a lo largo de la línea media. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior y el tercer ventrículo y la capacidad de dirigirse consistentemente a núcleos cerebrales selectivos y discretos. Además, las técnicas de neurociencia más avanzadas (por ejemplo, optogenética, fotometría de fibra e imágenes de dos fotones) se basan en la implantación dirigida de hardware significativo para el cerebro, y las limitaciones espaciales son un obstáculo común. Aquí se presenta un protocolo modificable para la orientación estereotáctica de las estructuras cerebrales de roedores utilizando un enfoque coronal en ángulo. Se puede adaptar a 1) modelos de ratón o rata, 2) varias técnicas de neurociencia y 3) múltiples regiones cerebrales. Como ejemplo representativo, incluye el cálculo de coordenadas estereotácticas para la orientación del núcleo ventromedial hipotalámico de ratón (VMN) para un experimento de inhibición optogenética. Este procedimiento comienza con la microinyección bilateral de un virus adenoasociado (AAV) que codifica un canal de cloruro sensible a la luz (SwiChR ++) a un modelo de ratón dependiente de Cre, seguido de la implantación bilateral en ángulo de cánulas de fibra óptica. Usando este enfoque, los hallazgos muestran que la activación de un subconjunto de neuronas VMN es necesaria para las respuestas contrarreguladoras de glucosa intacta a la hipoglucemia inducida por insulina.
Introduction
El control neuronal del comportamiento, la alimentación y el metabolismo implica la coordinación de neurocircuitos altamente complejos, integradores y redundantes. Un objetivo impulsor del campo de la neurociencia es diseccionar la relación entre la estructura y la función del circuito neuronal. Aunque las herramientas clásicas de neurociencia (es decir, lesiones, inyecciones farmacológicas locales y estimulación eléctrica) han descubierto un conocimiento vital sobre el papel de regiones cerebrales específicas que controlan el comportamiento y el metabolismo, estas herramientas están limitadas por su falta de especificidad y reversibilidad1.
Los avances recientes en el campo de la neurociencia han mejorado en gran medida la capacidad de interrogar y manipular la función del circuito de una manera específica de tipo celular con alta resolución espaciotemporal. Los enfoques optogenético2 y quimiogenético3, por ejemplo, permiten la manipulación rápida y reversible de la actividad en tipos de células genéticamente definidas de animales que se mueven libremente. La optogenética implica el uso de canales iónicos sensibles a la luz, denominados canalrhodopsinas, para controlar la actividad neuronal. La clave de esta técnica es la entrega génica de canalrhodopsina y una fuente de luz para activar la opsina. Una estrategia común para la entrega de genes es a través de una combinación de 1) ratones genéticamente modificados que expresan Cre-recombinasa en neuronas discretas, y 2) vectores virales dependientes de Cre que codifican canalrhodopsina.
Si bien la optogenética proporciona un medio elegante y altamente preciso para controlar la actividad neuronal, el método depende de la microinyección estereotáctica exitosa del vector viral y la colocación de fibra óptica en una región cerebral definida. Aunque los procedimientos estereotácticos son comunes dentro del laboratorio de neurociencia moderno (y hay varios protocolos excelentes que describen este procedimiento)4,5,6, ser capaz de dirigirse de manera consistente y reproducible a regiones cerebrales discretas a lo largo de la línea media (es decir, el hipotálamo mediobasal, un área del cerebro crítica para la regulación de las funciones homeostáticas7)presenta desafíos adicionales. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior, el tercer ventrículo y los núcleos hipotalámicos adyacentes. Además, existen limitaciones espaciales significativas para la implantación bilateral de hardware que se requiere para los estudios de inhibición. Con estos desafíos en mente, este protocolo presenta un procedimiento modificable para apuntar a regiones cerebrales discretas a través de un enfoque estereotáctico en ángulo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los avances recientes en neurociencia han apoyado la comprensión y la comprensión avanzadas de la actividad y la función de los neurocircuitos cerebrales. Esto incluye la aplicación de tecnologías optogenéticas y quimiogenéticas para activar o silenciar poblaciones neuronales discretas y sus sitios de proyección in vivo. Más recientemente, esto ha incluido el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente (por ejemplo, GCaMP, RCaMP) y otros biosensores fluorométricos (por ejemplo, dopamina, nore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un Premio de Ciencia Básica Innovadora de la Asociación Americana de Diabetes (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) y el Centro de Investigación de obesidad nutricional financiado por NIDDK (DK-035816), el Centro de Investigación de Diabetes (DK-017047) y Diabetes, Beca de entrenamiento en obesidad y metabolismo T32 DK0007247 (T.H.M) en la Universidad de Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
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