Anpassningsbart vinklat stereotaktiskt tillvägagångssätt för mångsidig neurovetenskaplig teknik
Summary
Beskrivs här är en stereotaktisk procedur som kan rikta sig till utmanande och svår att nå hjärnregioner (på grund av rumsliga begränsningar) med hjälp av en vinklad korona tillvägagångssätt. Detta protokoll är anpassningsbart till både mus- och råttmodeller och kan tillämpas på olika neurovetenskapliga tillämpningar, inklusive kanylimplantation och mikroinjektioner av viruskonstruktioner.
Abstract
Stereotaktisk kirurgi är ett viktigt verktyg i det moderna neurovetenskapliga labbet. Förmågan att exakt och exakt rikta in sig på svår att nå hjärnregioner utgör dock fortfarande en utmaning, särskilt när man riktar in sig på hjärnstrukturer längs mittlinjen. Dessa utmaningar inkluderar undvikande av överlägsen sagittal sinus och tredje ventrikel och förmågan att konsekvent rikta selektiva och diskreta hjärnan atomkärnor. Dessutom förlitar sig mer avancerade neurovetenskapliga tekniker (t.ex. optogenetik, fiberfotometri och två-fotonavbildning) på riktad implantation av betydande hårdvara till hjärnan, och rumsliga begränsningar är ett vanligt hinder. Presenteras här är ett modifierbart protokoll för stereotaktisk inriktning av gnagare hjärnstrukturer med hjälp av en vinklad koronala strategi. Det kan anpassas till 1) mus- eller råttmodeller, 2) olika neurovetenskapliga tekniker och 3) flera hjärnregioner. Som ett representativt exempel inkluderar det beräkningen av stereotaktiska koordinater för inriktning av musen hypotalamus ventromedial kärnan (VMN) för ett optogenetiskt hämningsexperiment. Detta förfarande börjar med bilaterala microinjection av en adeno-associerade virus (AAV) kodning en ljuskänslig klorid kanal (SwiChR ++) till en Cre-beroende mus modell, följt av vinklad bilaterala implantation av fiberoptiska kanyl. Med hjälp av detta tillvägagångssätt visar resultaten att aktivering av en delmängd av VMN nervceller krävs för intakt glukos motreglering svar på insulin-inducerad hypoglykemi.
Introduction
Neural kontroll av beteende, utfodring och metabolism innebär samordning av mycket komplexa, integrativa och redundanta neurokretsar. Ett drivande mål för neurovetenskapsfältet är att dissekera förhållandet mellan neuronal kretsstruktur och funktion. Även om klassiska neurovetenskapliga verktyg (dvs. lesioning, lokala farmakologiska injektioner och elektrisk stimulering) har upptäckt vital kunskap om rollen hos specifika hjärnregioner som kontrollerar beteende och metabolism, begränsas dessa verktyg av deras brist på specificitet och reversibilitet1.
De senaste framstegen inom neurovetenskapsområdet har avsevärt förbättrat förmågan att förhöra och manipulera kretsfunktionen på ett celltypsspecifikt sätt med hög spatiotemporal upplösning. Optogenetiska2- och kemogenetiska3-metoder möjliggör till exempel snabb och reversibla manipulering av aktivitet hos genetiskt definierade celltyper av fritt rörliga djur. Optogenetik innebär användning av ljuskänsliga jonkanaler, så kallade channelrhodopsins, för att kontrollera neuronal aktivitet. Nyckeln till denna teknik är gen leverans av channelrhodopsin och en ljuskälla för att aktivera opsin. En vanlig strategi för genleverans är genom en kombination av 1) genetiskt konstruerade möss som uttrycker Cre-rekombinas i diskreta nervceller och 2) Cre-beroende virusvektorer kodning channelrhodopsin.
Medan optogenetik ger ett elegant, mycket exakt sätt att kontrollera neuronal aktivitet, är metoden beroende av framgångsrik stereotaktisk mikroinjektion av virusvektorn och fiberoptisk placering i en definierad hjärnregion. Även om stereotaktiska procedurer är vanliga inom det moderna neurovetenskapliga labbet (och det finns flera utmärkta protokoll som beskriver dettaförfarande) 4,5,6, att konsekvent och reproducerbart rikta diskreta hjärnregioner längs mittlinjen (dvs. den mediobasala hypotalamus, ett hjärnområde som är kritiskt för regleringen av homeostatiska funktioner7) innebär ytterligare utmaningar. Dessa utmaningar inkluderar undvikande av överlägsen sagittal sinus, tredje ventrikel och intilliggande hypotalamus atomkärnor. Dessutom finns det betydande rumsliga begränsningar för bilateral implantation av hårdvara som krävs för hämningsstudier. Med dessa utmaningar i åtanke presenterar detta protokoll häri ett modifierbart förfarande för att rikta in sig på diskreta hjärnregioner via en vinklad stereotaktisk strategi.
Protocol
Representative Results
Discussion
De senaste framstegen inom neurovetenskap har stött avancerad insikt och förståelse för aktiviteten och funktionen hos hjärnans neurokretsar. Detta inkluderar tillämpningen av optogenetisk och kemogenetisk teknik för att aktivera eller tysta diskreta neuronala populationer och deras projektionsplatser in vivo. På senare tid har detta inkluderat utveckling av genetiskt kodade kalciumindikatorer (t.ex. GCaMP, RCaMP) och andra fluorometriska biosensorer (t.ex. dopamin, noradrenalin) för in vivo-registrering av neur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) beviljar F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), american diabetes association innovative basic science award (#1-19-IBS-192 till G.J.M.) och NIDDK-finansierade Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) och Diabetes, Fetma och metabolism utbildning grant T32 DK0007247 (T.H.M) vid University of Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
