محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري
Summary
نقدم سير العمل المتوفرة مجانا بنيت لاستكشاف سريع وتحليل دقيق للأجسام الخلوية في مقصورات خلية محددة في الصور المجهرية الفلوريس. تم تصميم سير العمل سهل الاستخدام هذا على برنامج المصدر المفتوح Icy ويستخدم أيضًا وظائف ImageJ. خط الأنابيب بأسعار معقولة دون معرفة في تحليل الصور.
Abstract
وقد اتسم العقد الماضي باختراقات في تقنيات المجهر المفلورية التي يتضح منها تحسين الدقة المكانية ولكن أيضا في التصوير بالخلايا الحية وتقنيات المجهر عالية الإنتاجية. وأدى ذلك إلى زيادة مستمرة في كمية وتعقيد بيانات المجهر لتجربة واحدة. لأن التحليل اليدوي لبيانات المجهر يستغرق وقتا طويلا جدا، وذاتية، ويحظر التحليل الكمي، أتمتة تحليل الصورة الحيوية أصبح من المحتم تقريبا. لقد قمنا ببناء سير عمل معلوماتي يسمى محلل البنية الفرعية لأتمتة تحليل الإشارة بالكامل في الصور الحيوية من المجهر الفلورسنت. تم تطوير هذا العمل على منصة مفتوحة المصدر سهلة الاستخدام Icy ويتم إكمالها من قبل وظائف من ImageJ. ويشمل المعالجة المسبقة للصور لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتجزئة الخلايا الفردية (الكشف عن حدود الخلايا) والكشف/القياس الكمي للأجسام الخلوية التي يتم إثراؤها في مقصورات خلايا محددة. وتتمثل الميزة الرئيسية لسير العمل هذا في اقتراح وظائف معقدة للتصوير الحيوي للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور من خلال واجهة سهلة الاستخدام. وعلاوة على ذلك، فهي وحدات معيارية بدرجة عالية ومتكيفة مع عدة مسائل من توصيف نقل التكنولوجيات النووية/السيتوبلازمية إلى التحليل المقارن لمختلف أجسام الخلايا في مختلف الهياكل الفرعية الخلوية. ويتضح من وظيفة هذا العمل من خلال دراسة الهيئات Cajal (ملفوف) في ظروف الإجهاد التأسدي (OS). تظهر البيانات المستقاة من المجهر المفلور أن سلامتها في الخلايا البشرية تتأثر بعد ساعات قليلة من تحريض نظام التشغيل. ويتميز هذا التأثير بانخفاض نوى اللفائف في الأجسام Cajal مميزة، المرتبطة إعادة توزيع نووكلوباسميك من الملف إلى عدد متزايد من بؤر أصغر. يشير الدور المركزي لللفائف في التبادل بين مكونات CB والنيوكلوباسم المحيطة به إلى أن نظام التشغيل المستحث بإعادة توزيع اللفائف يمكن أن يؤثر على تكوين ووظائف هيئات Cajal.
Introduction
المجهر الخفيف، وبشكل خاص، المجهر الفلوري هي تقنيات قوية ومتعددة الاستخدامات تستخدم عادة في العلوم البيولوجية. أنها تعطي الوصول إلى التعريب الدقيق للجزيئات الحيوية المختلفة مثل البروتينات أو الحمض النووي الريبي من خلال وضع العلامات الفلورية المحددة. وقد تميز العقد الماضي من التقدم السريع في تقنيات المجهر والتصوير كما يتضح من جائزة نوبل في الكيمياء 2014 منح اريك Betzig, ستيفان W. الجحيم ووليام E. Moerner لتطوير المجهر الفلورانس فائقة حل (SRFM)1. تتجاوز SFRM حد الانعراج من المجهر البصري التقليدي لإدخاله في نانوديمينسين. كما أن تحسين تقنيات مثل التصوير الحي أو نهج الفرز عالي الإنتاجية يزيد من كمية البيانات التي يجب معالجتها لكل تجربة وتعقيدها. في معظم الأحيان، يواجه الباحثون مجموعات سكانية غير متجانسة عالية من الخلايا ويريدون تحليل الأنماط الظاهرية على مستوى الخلية الواحدة.
في البداية، تم إجراء تحليلات مثل عد البؤر بالعين، وهو ما يفضله بعض الباحثين لأنه يوفر تحكمًا بصريًا كاملًا في عملية العد. ومع ذلك ، فإن التحليل اليدوي لهذه البيانات يستغرق وقتا طويلا للغاية ، ويؤدي إلى التباين بين المراقبين ، ولا يتيح الوصول إلى ميزات أكثر تعقيدا بحيث أصبحت النهج بمساعدة الكمبيوتر تستخدم على نطاق واسع ولا يمكن تجنبها تقريبا2. أساليب المعلوماتية الحيوية تزيد بشكل كبير من كفاءة تحليل البيانات وخالية من الذاتية المشغل لا يمكن تجنبها والتحيز المحتمل لتحليل العد اليدوي. أدى الطلب المتزايد في هذا المجال وتحسين قوة الكمبيوتر إلى تطوير عدد كبير من منصات تحليل الصور. وبعضها متاح مجاناً ويمنح إمكانية الوصول إلى أدوات مختلفة لإجراء التحليل باستخدام أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وقد تم مؤخرا وضع تصنيف لأدوات الوصول المفتوح3 ويعرض Icy4 كبرمجيات قوية تجمع بين سهولة الاستخدام والوظائف. وعلاوة على ذلك ، فإن الجليدية لديها ميزة التواصل مع ImageJ.
بالنسبة للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور، فإن العقبات الرئيسية هي اختيار الأداة المناسبة وفقاً للمحددات الإشكالية والمتناغمة بشكل صحيح التي غالباً ما تكون غير مفهومة جيداً. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تكون أوقات الإعداد طويلة. يقترح Icy واجهة نقطة وانقر سهلة الاستخدام تسمى “بروتوكولات” لتطوير سير العمل من خلال الجمع بين بعض الإضافات الموجودة ضمن مجموعة شاملة4. تصميم وحدات مرنة وواجهة نقطة وانقر جعل إعداد تحليل ممكن بالنسبة لغير المبرمجين. هنا نقدم سير العمل يسمى محلل الهيكل الفرعي، وضعت في واجهة الجليدية ، وظيفتها هي تحليل الإشارات الفلورية في مقصورات خلوية محددة وقياس ميزات مختلفة مثل السطوع ، وعدد بؤر ، وحجم بؤر ، والتوزيع المكاني. هذا سير العمل يعالج العديد من القضايا مثل الكم من نقل إشارة، وتحليل الخلايا المُصابة التي تعبر عن مراسل الفلورسنت، أو تحليل بؤر من الهياكل الفرعية الخلوية المختلفة في الخلايا الفردية. وهو يسمح بمعالجة صور متعددة في وقت واحد، ويتم تصدير نتائج المخرجات إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة يمكن فتحها في برامج جداول البيانات شائعة الاستخدام.
يتم عرض خط أنابيب محلل البنية الفرعية في الشكل 1. أولاً، يتم معالجة كافة الصور الموجودة في مجلد محدد مسبقًا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه الخطوة يزيد من كفاءة الخطوات التالية ويقلل من وقت التشغيل. ثم يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) ، المقابلة لمناطق الصورة التي يجب اكتشاف إشارة الفلورسنت فيها ، وتقسيمها. وأخيراً، يتم تحليل إشارة الفلورسنت، ويتم تصدير النتائج إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة.
تجزئة الكائنات (الكشف عن الحدود) هي الخطوة الأكثر صعوبة في تحليل الصور، والكفاءة يحدد دقة القياسات الخلية الناتجة. الكائنات الأولى التي تم تحديدها في صورة (تسمى الكائنات الأولية) غالبا ما تكون نوية من الصور الملطخة بالحمض النووي (DAPI أو Hoechst تلطيخ)، على الرغم من أن الكائنات الأولية يمكن أن تكون أيضا خلايا كاملة، الخرز، البقع، الأورام، أو أيا كانت الكائنات الملطخة. في معظم الصور البيولوجية، الخلايا أو النوى لمس بعضها البعض أو التداخل مما تسبب في الخوارزميات البسيطة والسريعة للفشل. حتى الآن، لا يمكن لأي خوارزمية عالمية تنفيذ تجزئة مثالية لجميع الكائنات، ويرجع ذلك في الغالب إلى خصائصها (الحجم أو الشكل أو الملمس) تعدل كفاءة تجزئة5. تعتمد أدوات التقسيم التي يتم توزيعها عادةً مع برامج الفحص المجهري (مثل برنامج التصوير المتحول بواسطة الأجهزة الجزيئية6، أو برنامج أبحاث تقدمات NIS-Elements بواسطة Nikon7)بشكل عام على التقنيات القياسية مثل مطابقة الارتباط أو العتبة أو العمليات المورفولوجية. وعلى الرغم من كفاءة هذه الأساليب العامة في النظم الأساسية، فإن هذه الأساليب التي تتسم بالإفراط في التعميم تفرض بسرعة قيوداً عند استخدامها في سياقات أكثر صعوبة وتحديداً. في الواقع، تجزئة حساسة للغاية لالمعلمات التجريبية مثل نوع الخلية، وكثافة الخلية، أو المؤشرات الحيوية، وكثيراً ما يتطلب التعديل المتكرر لمجموعة بيانات كبيرة. يدمج سير عمل محلل الهيكل الفرعي كلاً من الخوارزميات البسيطة والأكثر تعقيدًا لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم. ومن الجدير بالذكر أنه يقترح خوارزمية مستجمعات المياه القائمة على العلامة8 للكائنات متفاوتة المسافات العالية. تعتمد كفاءة أسلوب التجزئة هذا على تحديد علامات فردية على كل كائن. يتم اختيار هذه العلامات يدويا معظم الوقت للحصول على المعلمات الصحيحة لتقسيم كامل، والتي تستغرق وقتا طويلا للغاية عندما يواجه المستخدمون عددا كبيرا من الكائنات. محلل البنية الفرعية يقترح الكشف التلقائي لهذه العلامات، وتوفير عملية تجزئة عالية الكفاءة. تجزئة هو ، في معظم الأحيان ، والحد من خطوة تحليل الصور ويمكن أن تعديل بشكل كبير في وقت المعالجة اعتمادا على دقة الصورة ، وعدد الكائنات في الصورة الواحدة ، ومستوى التجمع من الكائنات. خطوط الأنابيب النموذجية تتطلب بضع ثوان إلى 5 دقائق لكل صورة على كمبيوتر سطح المكتب القياسية. تحليل الصور أكثر تعقيدا يمكن أن تتطلب جهاز كمبيوتر أكثر قوة وبعض المعرفة الأساسية في تحليل الصور.
ويتضح من مرونة هذا العمل ووظيفته مع مختلف الأمثلة في النتائج التمثيلية. وتظهر مزايا هذا العمل بشكل ملحوظ من خلال دراسة الهياكل الفرعية النووية في ظل ظروف الإجهاد التأسدي .( نظام التشغيل يتوافق مع اختلال التوازن في الأكسدة الحمراء لصالح المؤكد ويرتبط مع مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS). منذ ROS بمثابة جزيئات الإشارة، والتغيرات في تركيزها وتوطين الخلايا الفرعية تؤثر إيجابا أو سلبا على عدد لا يحصى من المسارات والشبكات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نقل الإشارة، وآليات الإصلاح، والتعبير الجيني، وموت الخلايا، وانتشار9،,10. وبالتالي فإن نظام التشغيل يشارك بشكل مباشر في مختلف الأمراض (أمراض الأعصاب والقلب والأوعية الدموية والسرطان والسكري، وما إلى ذلك)، ولكن أيضا الشيخوخة الخلوية. لذلك، فك نتائج نظام التشغيل على تنظيم الخلية البشرية ووظيفته يشكل خطوة حاسمة في فهم أدوار نظام التشغيل في بداية وتطور الأمراض البشرية. وقد ثبت أن نظام التشغيل ينظم التعبير الجيني عن طريق تعديل النسخ من خلال عدة عوامل النسخ (P53، Nrf2، FOXO3A)11، ولكن أيضا عن طريق التأثير على تنظيم عدة عمليات المشاركة وما بعد النسخ مثل الربط البديل (AS) من ما قبل RNAs12،13،14. إن الربط البديل للنصوص الأولية للتشفير والنصوص غير البرمجةية هو آلية أساسية تزيد من قدرة الترميز على الجينوم عن طريق إنتاج أشكال متساوية. يتم تنفيذ AS بواسطة مجمع كبير ribonucleoprotein يسمى spliceosome ، يحتوي على ما يقرب من 300 بروتين و 5 U-الغنية RNAs النووية الصغيرة (UsnRNAs)15. يتم التحكم بإحكام في تجميع spliceosome و AS في الخلايا وتحدث بعض خطوات نضج الطمي داخل المقصورات النووية أقل غشاء اسمه الهيئات Cajal. وتتميز هذه الهياكل الفرعية النووية بالطبيعة الديناميكية لهيكلها وتكوينها، والتي تتم بشكل رئيسي من خلال التفاعلات متعددة التكافؤ لمكونات الحمض النووي الريبي والبروتين مع بروتين اللفائف. تحليل الآلاف من الخلايا مع سير عمل محلل الهيكل الفرعي سمح توصيف أبدا وصفها من آثار نظام التشغيل على الهيئات Cajal. في الواقع، تشير البيانات التي تم الحصول عليها إلى أن نظام التشغيل يعدل نووية الأجسام Cajal، مما يحفز إعادة توزيع نووكلوباسميك من بروتين اللفائف إلى العديد من بؤر النووية الصغيرة. مثل هذا التغيير في هيكل الهيئات Cajal قد تؤثر على نضوج spliceosome والمشاركة في تعديل AS بواسطة نظام التشغيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدد متزايد من البرمجيات الحرة المتاحة لتحليل الصور الخلايا المفلورة. يجب على المستخدمين اختيار البرامج المناسبة بشكل صحيح وفقا لتعقيد إشكالية ، إلى معرفتهم في معالجة الصور ، والوقت الذي يريدون قضاءه في تحليلهم. الجليدية، CellProfiler، أو ImageJ / فيجي هي أدوات قوية تجمع بين قابلية الاستخدام والوظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم G.H. من قبل زمالة الدراسات العليا من Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. وقد تم دعمها من قبل زمالة الدراسات العليا من معهد الكانتيرولوجيا دي لورين (ICL)، في حين تم دعم Q.T. من قبل منحة عامة أشرفت عليها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR) كجزء من “Investissements d’Avenir” برنامج FIGHT-HF (المرجع: ANR-15-RHU4570004). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CNRS وجامعة لورين (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
