Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden
Summary
We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.
Abstract
Het laatste decennium werd gekenmerkt door doorbraken in fluorescentie microscopie technieken geïllustreerd door verbetering van de ruimtelijke resolutie, maar ook in live-cel beeldvorming en high-throughput microscopie technieken. Dit leidde tot een constante toename van de hoeveelheid en complexiteit van de microscopiegegevens voor één experiment. Omdat handmatige analyse van microscopiegegevens zeer tijdrovend, subjectief is en kwantitatieve analyses verbiedt, wordt automatisering van bioimageanalyse bijna onvermijdelijk. We bouwden een informatica workflow genaamd Substructure Analyzer om de signaalanalyse volledig te automatiseren in biobeelden van fluorescerende microscopie. Deze workflow is ontwikkeld op het gebruiksvriendelijke open-source platform Icy en wordt aangevuld met functionaliteiten van ImageJ. Het omvat de voorbewerking van beelden om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de individuele segmentatie van cellen (detectie van celgrenzen) en de detectie/kwantificering van cellichamen verrijkt in specifieke celcompartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is om complexe bio-imaging functionaliteiten voor te stellen aan gebruikers zonder kennisanalyse expertise via een gebruiksvriendelijke interface. Bovendien is het zeer modulair en aangepast aan verschillende kwesties van de karakterisering van nucleaire / cytoplasmische translocatie aan de vergelijkende analyse van verschillende cellichamen in verschillende cellulaire substructuren. De functionaliteit van deze workflow wordt geïllustreerd door de studie van de Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) voorwaarden. Gegevens van fluorescentiemicroscopie tonen aan dat hun integriteit in menselijke cellen een paar uur na de inductie van OS wordt beïnvloed. Dit effect wordt gekenmerkt door een afname van coilin nucleatie in karakteristieke Cajal Bodies, geassocieerd met een nucleoplasmische herverdeling van coilin in een verhoogd aantal kleinere foci. De centrale rol van coilin in de uitwisseling tussen CB-componenten en het omringende nucleoplasma suggereert dat os-geïnduceerde herverdeling van coilin de samenstelling en de functionaliteit van Cajal Bodies kan beïnvloeden.
Introduction
Lichte microscopie en, meer in het bijzonder, fluorescentiemicroscopie zijn robuuste en veelzijdige technieken die vaak worden gebruikt in de biologische wetenschappen. Ze geven toegang tot de precieze lokalisatie van verschillende biomoleculen zoals eiwitten of RNA door hun specifieke fluorescerende etikettering. Het afgelopen decennium is gekenmerkt door snelle vooruitgang in microscopie en imaging technologieën zoals blijkt uit de 2014 Nobelprijs voor de Scheikunde toekenning Eric Betzig, Stefan W. Hell en William E. Moerner voor de ontwikkeling van super-resolved fluorescentie microscopie (SRFM)1. SFRM omzeilt de diffractielimiet van traditionele optische microscopie om deze in de nanodimensie te brengen. Verbetering van technieken zoals live-imaging of hoge doorvoer screening benaderingen verhoogt ook de hoeveelheid en de complexiteit van de gegevens te behandelen voor elk experiment. De meeste van de tijd, onderzoekers worden geconfronteerd met hoge heterogene populaties van cellen en willen fenotypes te analyseren op het eencellige niveau.
Aanvankelijk werden analyses zoals foci tellen uitgevoerd door het oog, wat de voorkeur heeft van sommige onderzoekers, omdat het volledige visuele controle biedt over het telproces. Handmatige analyse van dergelijke gegevens is echter te tijdrovend, leidt tot variabiliteit tussen waarnemers en geeft geen toegang tot complexere functies, zodat computerondersteunde benaderingen op grote schaal worden gebruikt en bijna onvermijdelijk2. Bioimage informaticamethoden verhogen de efficiëntie van data-analyse aanzienlijk en zijn vrij van de onvermijdelijke operator subjectiviteit en potentiële bias van de handmatige telanalyse. De toegenomen vraag op dit gebied en de verbetering van computerkracht leidden tot de ontwikkeling van een groot aantal beeldanalyseplatforms. Sommigen van hen zijn vrij beschikbaar en geven toegang tot verschillende tools om analyse uit te voeren met personal computers. Een classificatie van open access tools is onlangs opgericht3 en presenteert Icy4 als een krachtige software die bruikbaarheid en functionaliteit combineert. Bovendien heeft Icy het voordeel van de communicatie met ImageJ.
Voor gebruikers zonder expertise op het gebied van beeldanalyse zijn de belangrijkste obstakels het kiezen van het juiste gereedschap op basis van de problematische en correct afgestemde parameters die vaak niet goed worden begrepen. Bovendien zijn de insteltijden vaak lang. Icy stelt een gebruiksvriendelijke point-and-click interface genaamd “Protocollen” voor om workflow te ontwikkelen door een aantal plug-ins te combineren die in een uitputtende verzameling zijn gevonden4. Het flexibele modulaire ontwerp en de point-and-click interface maken het opzetten van een analyse haalbaar voor niet-programmeurs. Hier presenteren we een workflow genaamd Substructure Analyzer, ontwikkeld in Icy’s interface, wiens functie is om fluorescerende signalen in specifieke cellulaire compartimenten te analyseren en verschillende functies te meten als helderheid, foci-getal, foci-grootte en ruimtelijke verdeling. Deze workflow behandelt verschillende kwesties, zoals kwantificering van signaaltranslocatie, analyse van doorfecteerde cellen die een fluorescerende reporter uitdrukken, of analyse van foci uit verschillende cellulaire substructuren in individuele cellen. Hiermee u meerdere afbeeldingen gelijktijdig verwerken en worden uitvoerresultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad dat kan worden geopend in veelgebruikte spreadsheetprogramma’s.
De substructuuranalyzerpijplijn wordt gepresenteerd in figuur 1. Ten eerste worden alle afbeeldingen in een opgegeven map vooraf verwerkt om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Deze stap verhoogt de efficiëntie van de volgende stappen en vermindert de looptijd. Vervolgens worden de regio’s van belang (ROI’s), die overeenkomen met de afbeeldingsgebieden waar het fluorescerende signaal moet worden gedetecteerd, geïdentificeerd en gesegmenteerd. Ten slotte wordt het fluorescerende signaal geanalyseerd en worden de resultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad.
Objectsegmentatie (detectie van grenzen) is de meest uitdagende stap in beeldanalyse en de efficiëntie ervan bepaalt de nauwkeurigheid van de resulterende celmetingen. De eerste objecten geïdentificeerd in een afbeelding (de zogenaamde primaire objecten) zijn vaak kernen van DNA-gekleurde beelden (DAPI of Hoechst vlekken), hoewel primaire objecten kunnen ook hele cellen, kralen, spikkels, tumoren, of wat gekleurde objecten. In de meeste biologische beelden raken cellen of kernen elkaar of overlappen elkaar waardoor de eenvoudige en snelle algoritmen mislukken. Tot op heden kan geen enkel universeel algoritme een perfecte segmentatie van alle objecten uitvoeren, vooral omdat hun kenmerken (grootte, vorm of textuur) de efficiëntie van segmentatie5moduleren. De segmentatietools die gewoonlijk worden gedistribueerd met microscopiesoftware (zoals de MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, of de NIS-Elements Advances Research software van Nikon7) zijn over het algemeen gebaseerd op standaardtechnieken zoals correlatiematching, thresholding of morfologische bewerkingen. Hoewel efficiënt in basissystemen, deze overgegeneraliseerde methoden snel presenteren beperkingen bij gebruik in meer uitdagende en specifieke contexten. Segmentatie is namelijk zeer gevoelig voor experimentele parameters zoals celtype, celdichtheid of biomarkers en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote gegevensset. De Substructure Analyzer workflow integreert zowel eenvoudige als meer geavanceerde algoritmen om verschillende alternatieven voor te stellen die zijn aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker. Het stelt met name de marker-gebaseerde waterscheiding algoritme8 voor sterk geclusterde objecten. De efficiëntie van deze segmentatiemethode is afhankelijk van de selectie van afzonderlijke markeringen op elk object. Deze markeringen worden meestal handmatig gekozen om de juiste parameters voor volledige segmentatie te krijgen, wat zeer tijdrovend is wanneer gebruikers geconfronteerd worden met een groot aantal objecten. Substructuur Analyzer stelt een automatische detectie van deze markers voor, wat een zeer efficiënt segmentatieproces biedt. Segmentatie is meestal de beperkende stap van beeldanalyse en kan de verwerkingstijd aanzienlijk wijzigen, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding, het aantal objecten per afbeelding en het niveau van clustering van objecten. Typische pijplijnen vereisen enkele seconden tot 5 minuten per afbeelding op een standaard desktopcomputer. Analyse van complexere beelden kan een krachtigere computer en enige basiskennis in beeldanalyse vereisen.
De flexibiliteit en functionaliteit van deze workflow worden geïllustreerd met verschillende voorbeelden in de representatieve resultaten. De voordelen van deze workflow worden met name weergegeven door de studie van nucleaire substructuren onder oxidatieve stress (OS) omstandigheden. OS komt overeen met een onbalans van de redox homeostase ten gunste van oxidanten en wordt geassocieerd met hoge niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Aangezien ROS fungeren als signaalmoleculen, beïnvloeden veranderingen in hun concentratie en subcellulaire lokalisatie positief of negatief een groot aantal trajecten en netwerken die fysiologische functies reguleren, waaronder signaaltransductie, reparatiemechanismen, genexpressie, celdood en proliferatie9,10. OS is dus direct betrokken bij verschillende pathologieën (neurodegeneratieve en hart- en vaatziekten, kankers, diabetes, enz.), maar ook cellulaire veroudering. Daarom is het ontcijferen van de gevolgen van OS op de organisatie en functie van de menselijke cel een cruciale stap in het begrijpen van de rol van OS in het begin en de ontwikkeling van menselijke pathologieën. Er is vastgesteld dat OS genexpressie reguleert door transcriptie te moduleren via verschillende transcriptiefactoren (p53, Nrf2, FOXO3A)11, maar ook door de regulering van verschillende co- en posttranscriptieprocessen zoals alternatieve splicing (AS) van pre-RNAs12,13,,14. Alternatieve splicing van primaire codering en niet-coderende transcripties is een essentieel mechanisme dat de coderingscapaciteit van de genomen verhoogt door transcriptie-isovormen te produceren. AS wordt uitgevoerd door een enorm ribonucleoprotein complex genaamd spliceosoom, met bijna 300 eiwitten en 5 U-rijke kleine nucleaire RNAs (UsnRNAs)15. Spliceosoom assemblage en AS zijn strak gecontroleerd in cellen en sommige stappen van de spliceosoom rijping optreden binnen membraan-minder nucleaire compartimenten genaamd Cajal Bodies. Deze nucleaire substructuren worden gekenmerkt door de dynamische aard van hun structuur en hun samenstelling, die voornamelijk worden uitgevoerd door multivalente interacties van hun RNA en eiwitcomponenten met het coilin-eiwit. Analyse van duizenden cellen met de Substructure Analyzer-workflow liet karakterisering toe van nooit beschreven effecten van OS op Cajal Bodies. Inderdaad, verkregen gegevens suggereren dat OS wijzigt de nucleatie van Cajal Bodies, het induceren van een nucleoplasmische herverdeling van de coilin eiwit in tal van kleinere nucleaire foci. Een dergelijke verandering van de structuur van Cajal Bodies kan de rijping van het spliceosoom beïnvloeden en deelnemen aan AS-modulatie door OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een toenemend aantal vrije software tools zijn beschikbaar voor de analyse van fluorescentie celbeelden. Gebruikers moeten correct kiezen voor de adequate software op basis van de complexiteit van hun problematische, om hun kennis in beeldverwerking, en de tijd die ze willen doorbrengen in hun analyse. Icy, CellProfiler of ImageJ/Fiji zijn krachtige tools die zowel bruikbaarheid als functionaliteitcombineren 3. Icy is een stand-alone tool die een duidelijke grafische gebruikersinterface (GUI) pres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van de Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van het Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), terwijl Q.T. werd ondersteund door een overheidssubsidie onder toezicht van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) als onderdeel van het tweede “Investissements d’Avenir” programma FIGHT-HF (referentie: ANR-15-RHU4570004). Dit werk werd gefinancierd door CNRS en Université de Lorraine (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
