使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

摘要

轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制。在本方案中，我们提供了一种详细的方法，利用微流控小室对运动神经元轴突中酸性区室和线粒体的轴突运输进行示踪。

摘要

运动神经元（MNs）是具有极长轴突的高度极化细胞。轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制，参与神经元的生长、发育和存活。本文详细介绍了一种利用微流控室（MFCs）追踪运动神经元轴突中荧光标记细胞器轴突运输的方法。该方法快速、相对经济，并可实现对细胞内信号在空间和时间上的动态监测。我们逐步阐述了以下操作流程：1）聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控室的制备；2）在微流控室内接种脊髓腹侧组织块及分离的运动神经元培养；3）线粒体和酸性区室的标记，随后进行活细胞共聚焦成像；4）手动及半自动化的轴突运输分析。最后，我们展示了HB9::GFP标记的脊髓腹侧组织块轴突中线粒体与酸性区室运输行为的差异，验证了该系统的有效性。总体而言，本实验方案为研究多种轴突组分的运输过程提供了高效工具，同时也为微流控室的使用提供了简明指南，有助于探索空间分辨的实验设计可能性。

引言

运动神经元（MNs）是高度极化的细胞，具有长长的轴突，在成年人体中可长达一米。这一特性给运动神经元连接性和功能的维持带来了严峻挑战。因此，运动神经元依赖于从胞体到突触再返回的轴突内信息、细胞器和物质的正常运输。多种细胞组分，如蛋白质、RNA和细胞器，会定期通过轴突进行转运。线粒体是运动神经元中常规运输的重要细胞器。线粒体对运动神经元的正常活动和功能至关重要，负责ATP供应、钙缓冲以及信号传导过程^1,2。线粒体的轴突运输是一个被广泛研究的过程^3,4。有趣的是，已有研究报道线粒体运输缺陷参与多种神经退行性疾病，特别是在运动神经元疾病中发挥重要作用⁵。酸性区室是沿运动神经元轴突移动的另一类内在细胞器。酸性区室包括溶酶体、内体、反式高尔基体以及某些分泌性囊泡⁶。酸性区室轴突运输的缺陷也在多种神经退行性疾病中被发现⁷，近期研究进一步强调了其在运动神经元疾病中的重要性⁸。

为了高效研究轴突运输，通常使用能够分离胞体与轴突区室的微流控装置

方案

本方案中动物的护理和处理均在特拉维夫大学动物伦理委员会的监督和批准下进行。

1. 微生物燃料电池的制备

1. 在初级模具中浇铸 PDMS（图 1）
   1. 购买或按照详细方案制备初级模具（晶圆）⁹。
   2. 在进行涂覆步骤前，使用加压空气清除晶圆平台上的任何类型污物。晶圆表面应显得光滑且洁净。
   3. 用一个容器装入 50 mL 液氮。准备一支 10 mL 注射器和 23 G 针头。
      注意：从本步骤起的所有操作必须在化学通风橱中进行。
   4. 在化学通风橱中，使用注射器和针头吸取 2 mL 液氮。尽管看起来像是吸入了空气，但注射器内实际充满的是氮气（图 1A）。将含有晶圆的培养皿放入可密封的容器中。
   5. 旋开氯三甲基硅烷瓶盖，用装有氮气的注射器刺穿橡胶塞，将注射器中的全部内容物注入瓶中。不拔出针头，将瓶子倒置，回抽 2 mL 氯三甲基硅烷。
      注意：由于注射器内压力作用，少量氯三甲基硅烷会从针头喷出。为避免危险，请将针头指向通风橱内壁（图 1B）。
   ....

结果

按照所述方案，将小鼠胚胎HB9::GFP脊髓外植体培养于微流控装置中（图4A）。外植体培养7天后，轴突完全延伸至远端室。向远端和近端室分别加入Mitotracker Deep Red和Lysotracker Red染料，以标记线粒体和酸性区室（图4C）。对远端沟槽中的轴突进行成像，并按如下方式分析录像：首先，采用纤迹图（kymograph）分析比较总体运动分布（图4B,D）。该分析显示，仅在酸性区室中存在向逆向运输的偏向性（静止 = 77.1 ± 9.5%；逆向 = 16.9 ± 8.3%；顺向 = 6 ± 5%；图4E），而在线粒体运输中则无此偏向（静止 = 83.4 ± 6.8%；逆向 = 10.5 ± 6.9%；顺向 = .......

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种用于追踪运动神经元中线粒体和酸性区室轴突运输的系统。这种简化的体外平台可对神经元亚细胞区室进行精确的控制、监测和操作，从而实现对运动神经元局部功能的实验分析。该方案可用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）等运动神经元疾病，重点关注疾病中轴突运输功能障碍的潜在机制^10,16。此外，该系统还可用于研究神经营养因子^9,16、microRNA¹⁰、mRNA⁸以及标记蛋白在健康与病变的运动神经元或其他神经元（如感觉神经元⁹或交感神经元轴突¹⁴）中的运输过程。类似的方法也可应用于共培养系统中的细胞器运输研究，例如将运动神经元与骨骼肌细胞共培养¹²，或将交感.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50 mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 相机	安道尔
阿糖胞苷（Cytosine β-D-阿拉伯呋喃糖苷)	Sigma-Aldrich	C1768	2 mM 的过滤DDW储备液
B-27添加剂（50倍浓缩）	赛默飞世尔科技	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
1.25 mm 活检穿孔器	World Precision Instruments WPI	504530	用于大型微生物燃料电池的制备
6 mm 活检穿刺针	World Precision Instruments WPI	504533	用于小型微生物燃料电池的制备
7 mm 活检穿刺针	World Precision Instruments WPI	504534	用于大规模微生物燃料电池的制备
Bitplane Imaris 软件 - 版本 8.4.1	Imaris
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	5% w/v，溶于ddw
氯三甲基硅烷	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
密度梯度介质 - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNAse）	Sigma-Aldrich	DN-25	神经基础培养基中储存液浓度为10 mg/mL
道康宁高真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	用于环氧模具制备
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	用ddw按1:10稀释
Dumont精细镊子#55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
环氧树脂固化剂	Trias Chem S.R.L	IPE 743	用于环氧模具制备
环氧树脂	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	用于环氧模具制备
FIJI 软件	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
Glutamax 100X	赛默飞世尔科技	#35050-038
HB9:GFP 小鼠品系	杰克逊实验室	005029
HBSS 10X	赛默飞世尔科技	#14185-045	用ddw按1:10稀释，加入1% P/S，过滤
iQ 软件	安道尔
虹膜剪，弯型，10 cm	AS 医疗技术公司	11-441-10
虹膜剪，直型，9 cm	AS 医疗技术	11-440-09
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz L-15 培养基	赛默飞世尔科技	11415064
LysoTracker Red	赛默飞世尔科技	L7528
Mitotracker Deep-Red FM	赛默飞世尔科技	M22426
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049
尼康Eclipse Ti显微镜	尼康
青霉素-链霉素（P/S）溶液	生物工业公司	03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	#P8638	在过滤的1×PBS中按1:1000比例稀释
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	道康宁公司	#3097358-1004
牛胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T1426	储存液：25 mg/mL，溶于1×PBS
Vannas弹簧式显微解剖剪，3 mm刀头	F.S.T	15000-00
Yokogawa CSU X-1	横河