Axonal Transport av organeller i motor neuron kulturer med microfluidic Chambers System
Summary
Axonal transport är en viktig mekanism för motor neuron hälsa. I detta protokoll ger vi en detaljerad metod för att spåra axonal transport av sura fack och mitokondrierna i motor neuron axons med mikrofluidic kammare.
Abstract
Motoriska nervceller (MNs) är mycket polariserade celler med mycket långa axoner. Axonal transport är en viktig mekanism för MN hälsa, bidrar till neuronal tillväxt, utveckling, och överlevnad. Vi beskriver en detaljerad metod för användning av mikrofluidiska kammare (MMF) för att spåra axonal transport av fluorescerande märkta organeller i MN axons. Denna metod är snabb, relativt billig, och möjliggör övervakning av intracellulära ledtrådar i tid och rum. Vi beskriver ett steg för steg protokoll för: 1) Tillverkning av polydimetylsiloxan (PDMS) MFC; 2) Plätering av ventrala ryggmärg explants och MN separerad kultur i MBC; 3) Märkning av mitokondrierna och sura fack följt av levande confocal fantasi; 4) Manuell och halvautomatisk axonal transportanalys. Slutligen visar vi en skillnad i transport av mitokondrierna och sura avdelningar av HB9::GFP ventrala ryggmärg explant axoner som ett bevis på systemets giltighet. Sammantaget ger detta protokoll ett effektivt verktyg för att studera axonal transport av olika axonalkomponenter, samt en förenklad handbok för MFC-användning för att hjälpa till att upptäcka rumsliga experimentella möjligheter.
Introduction
MNs är mycket polariserade celler med långa axoner, når upp till en meter lång hos vuxna människor. Detta fenomen skapar en kritisk utmaning för underhåll av MN-anslutning och funktion. Följaktligen är MNs beroende av korrekt transport av information, organeller och material längs axonerna från cellkroppen till synapsen och ryggen. Olika cellulära komponenter, såsom proteiner, RNA och organeller transporteras regelbundet genom axoner. Mitokondrierna är viktiga organeller som rutinmässigt transporteras i MNs. Mitokondrierna är nödvändiga för korrekt aktivitet och funktion av MNs, som ansvarar för ATP-tillhandahållande, kalciumbuffertning och signalprocesser1,2. Axonal transport av mitokondrierna är en väl studerad process3,4. Intressant nog rapporterades defekter i mitokondriell transport vara inblandade i flera neurodegenerativa sjukdomar och särskilt i MN-sjukdomar5. Sura fack fungerar som ett annat exempel för inneboende organeller som rör sig längs MN axoner. Sura fack inkluderar lysosomer, endosomer, trans-Golgi-apparat och vissa sekretoriska blåsor6. Defekter i axonal transport av sura avdelningar hittades i flera neurodegenerativa sjukdomar samt7, och de senaste tidningarna belysa deras betydelse i MN sjukdomar8.
För att effektivt studera axonal transport används mikrofluidiska kammare som separerar somatiska och axonala fack ofta9,,10. De två betydande fördelarna med mikrofluidiska systemet, och uppdelningen och isoleringen av axoner, gör det idealiskt för studier av subcellulära processer11. Den rumsliga separationen mellan neuronala cellkroppar och axoner kan användas för att manipulera de extracellulära miljöerna i olika neuronala fack (t.ex. axoner vs soma). Biokemiska, neuronal tillväxt/degeneration, och immunofluorescens analyser alla dra nytta av denna plattform. MBC kan också hjälpa till att studera cell-till-cell kommunikation genom att coculturing nervceller med andra celltyper, såsom skelettmuskulaturen12,13,14.
Här beskriver vi ett enkelt men exakt protokoll för övervakning mitokondrierna och sura fack transport i motor nervceller. Vi visar vidare användningen av denna metod genom att jämföra den relativa andelen bakåtsträvande och anterograde rörliga organeller, samt fördelningen av transporthastighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi ett system för att spåra axonal transport av mitokondrierna och sura fack i motoriska nervceller. Denna förenklade in vitro-plattform möjliggör exakt kontroll, övervakning och manipulering av subcellulära neuronala fack, vilket möjliggör experimentell analys av motor neuron lokala funktioner. Detta protokoll kan vara användbart för att studera MN-sjukdomar som ALS, att fokusera på att förstå den underliggande mekanismen för axonal transport dysfunktion i sjukdomen<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (ISF, 561/11) och Europeiska forskningsrådet (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
