基于阻抗的癌细胞迁移和入侵的实时测量
Summary
癌症是一种致命的疾病，由于其转移到不同器官的能力。确定癌细胞在各种治疗条件下迁移和入侵的能力对于评估治疗策略至关重要。该协议提供了一种评估胶质细胞瘤癌细胞系的实时转移能力的方法。
Abstract
癌症产生是由于遗传不稳定、突变、环境和其他压力因素引起的细胞无节制。这些在复杂、多层分子信号网络中的异常导致异常细胞增殖和存活、细胞外基质退化和转移到远机关。据估计，大约90%的癌症相关死亡是由转移传播的直接或间接影响造成的。因此，建立一个高度可靠、全面的系统，以基因和环境操纵来描述癌细胞行为非常重要。这种系统可以清楚地理解癌症转移的分子调节，并有机会成功开发分层、精确的治疗策略。因此，准确确定癌细胞行为，如迁移和入侵与基因的增益或丧失功能，允许评估癌细胞的侵略性性质。基于细胞阻抗的实时测量系统使研究人员能够在整个实验中持续获取数据，并在各种实验条件下立即比较和量化结果。与传统方法不同，此方法不需要固定、染色和样品处理来分析迁移或入侵的细胞。本文着重介绍了胶质细胞瘤癌细胞迁移和入侵的实时测定过程。
Introduction
癌症是一种致命的疾病，由于其转移到不同器官的能力。确定癌症基因型和表型对于理解和设计有效的治疗策略至关重要。几十年的癌症研究已导致不同方法的发展和适应，以确定癌症基因型和表型。最新的技术发展之一是基于细胞阻抗对细胞迁移和入侵进行实时测量。细胞附着在基质和细胞接触中起着重要作用，细胞对细胞的沟通和组织调节、发育和维护。细胞粘附的异常导致细胞细胞接触丧失，细胞外基质（ECM）退化，细胞迁移和入侵能力的增强，所有这些都导致癌细胞转移到不同的器官11，2。2各种方法可用于确定细胞迁移（伤口愈合和博伊登室测定）和入侵（马特里格尔-博伊登室测定）3，4，5。3,4,5这些传统方法是半定量的，因为细胞需要在实验之前或之后用荧光染料或其他染料标记，以测量细胞表型。此外，在某些情况下，需要机械干扰来制造伤口，以测量细胞向伤口部位的迁移。此外，这些现有方法既耗时，且耗费人力，并且仅在一个时间点测量结果。此外，由于实验过程中处理不一致，这些方法容易进行不准确的测量。
与传统方法不同，实时细胞分析系统可实时测量细胞阻抗，无需细胞预或后染色和机械损伤。更重要的是，实验的持续时间可以延长，以便生物效应能够以时间相关的方式确定。执行实验是时间效率高，而不是劳动密集型。分析数据相对简单准确。与其他方法相比，该方法是测量细胞迁移和入侵66、7、8、97,8,9的最佳实时测量方法之一。
贾弗和基斯是第一个描述电极表面10细胞群的阻抗测量的第一个。实时细胞分析系统的工作原理相同。每个微孔的面积大约 80% 覆盖着一系列黄金微电极。当电极表面区域由于细胞的粘附或扩散而被细胞占用时，电阻抗会发生变化。这种阻抗显示为细胞指数，它与穿透微孔膜（该膜的中位孔径为8μm）11后覆盖电极表面积的细胞成正比。
Crk 和 CrkL 是含有 SH2 和 SH3 域的适应蛋白，在各种细胞功能中起着重要作用，如细胞骨架调节、细胞转化、增殖、粘附、上皮-梅辛位过渡、迁移、入侵和转移，通过调解许多信号通路11、12、13、14、15、16、1715,16中的蛋白质-蛋白质,12,13,14,相互作用，17, 18.因此，确定癌细胞的Crk/CrkL依赖性迁移和侵入性能力非常重要。进行了实时细胞分析，以确定在Crk和CrkL基因敲除后胶质细胞细胞的迁移和侵入性能力。
本文描述了对人类胶质细胞细胞的Crk-和CrkL介导迁移和入侵的详细测量。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用实时细胞分析系统实时测量细胞迁移和入侵是一种简单、快速和连续的监控过程，与在单个时间点提供数据的传统方法相比，具有多种显著的优势。与传统方法一样，必须针对实时细胞分析系统的每个细胞系优化实验条件，因为每个细胞系在粘附基、生长、细胞到细胞接触以及迁移和侵入性能力。由于这些差异，每个细胞系可能显示不同的细胞动力学和细胞阻抗。阻抗受井中种子的细胞数量?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Olivia Funk 在实时细胞分析系统数据方面提供的技术帮助。我们还感谢堪萨斯城儿童慈善中心编辑这份手稿。这项工作得到了汤姆·基维尼为儿科癌症研究（至TP）和儿童慈悲医院中西部癌症联盟合作伙伴顾问委员会（至TP）提供资金的支持。
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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