Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение способности раковых клеток мигрировать и вторгаться в различных условиях лечения имеет решающее значение для оценки терапевтических стратегий. Этот протокол представляет метод оценки метастатических способностей в реальном времени линии раковых клеток глиобластомы.
Рак возникает из-за неконтролируемого распространения клеток, инициированных генетической нестабильностью, мутациями, а также экологическими и другими факторами стресса. Эти приобретенные аномалии в сложных, многослойных молекулярных сигнальных сетях вызывают аномальное пролиферацию и выживание клеток, внеклеточную деградацию матрицы и метастазирование в отдаленные органы. Приблизительно 90% случаев смерти, связанных с раком, по оценкам, вызваны прямыми или косвенными последствиями метастатического распространения. Поэтому важно создать высоконадежную, всеобъемлющую систему для характеристики поведения раковых клеток при генетических и экологических манипуляциях. Такая система может дать четкое представление о молекулярной регуляции метастазах рака и возможности для успешного развития стратифицированных, точных терапевтических стратегий. Таким образом, точное определение поведения раковых клеток, таких как миграция и вторжение с увеличением или потерей функции генов (ы) позволяет оценить агрессивный характер раковых клеток. Система измерений в реальном времени, основанная на клеточной импедании, позволяет исследователям постоянно получать данные в ходе всего эксперимента и мгновенно сравнивать и количественно оценивать результаты в различных экспериментальных условиях. В отличие от обычных методов, этот метод не требует фиксации, окрашивания и обработки образцов для анализа клеток, которые мигрируют или вторгаются. В этом методическом документе особое внимание уделяется подробным процедурам определения миграции и вторжения раковых клеток глиобластомы в режиме реального времени.
Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение генотипов и фенотипов рака имеет решающее значение для понимания и разработки эффективных терапевтических стратегий. Десятилетия исследований рака привели к разработке и адаптации различных методов определения генотипов и фенотипов рака. Одним из последних технических разработок является измерение миграции и вторжения в реальном времени на основе клеточного импеданса. Сливки клеток к субстратам и контактам клеток играют важную роль в связи и регуляции, развитии и поддержании тканей. Аномалии в клеточной адгезии приводят к потере клеточного контакта, деградации внеклеточной матрицы (ECM) и приобретению мигрирующих и вторгающихся возможностей клетками, которые способствуют метастазам раковых клеток в различные органы1,2. Различные методы доступны для определения миграции клеток (заживление ран и Бойден камеры анализы) и вторжения (Matrigel-Boyden камеры анализ)3,4,5. Эти обычные методы являются полуколичественными, потому что клетки должны быть помечены флуоресцентным красителем или другими красителями до или после эксперимента для измерения фенотипов клеток. Кроме того, в некоторых случаях необходимы механические сбои для создания раны для измерения миграции клеток в место раны. Более того, эти существующие методы отнимают много времени, трудоемки и измеряют результаты только в одно время. Кроме того, эти методы склонны к неточным измерениям из-за непоследовательной обработки во время экспериментальной процедуры6.
В отличие от обычных методов, система анализа клеток в реальном времени измеряет клеточные импеданс в режиме реального времени, не требуя предварительного или постстождения и механического повреждения клеток. Что еще более важно, продолжительность эксперимента может быть продлена, с тем чтобы биологические эффекты могли определяться зависящим от времени образом. Выполнение эксперимента является эффективным по времени и не трудоемким. Анализ данных является относительно простым и точным. По сравнению с другими методами, этот метод является одним из лучших измерений в реальном времени для измерения миграции клеток и вторжения6,,77,8,,9.
Giaever и Keese были первыми, кто описал импеданс-измерение популяции клеток на поверхности электродов10. Система анализа клеток в реальном времени работает по тому же принципу. Площадь каждого микроплитного колодца составляет примерно 80% покрыто массивом золотых микроэлектродов. Когда площадь поверхности электрода занята клетками из-за присоединения или распространения клеток, электрический импульс меняется. Этот импеданс отображается как индекс клеток, который прямо пропорционален клеткам, покрывающим область поверхности электрода после того, как они проникают в микропористую мембрану (средний размер пор этой мембраны 8 мкм)11.
Crk и CrkL являются адаптерными белками, содержащими SH2 и SH3 домены и играют важную роль в различных клеточных функций, таких как цитоскелет регулирования, преобразование клеток, пролиферация, адгезия, эпителиал-мезенхимальный переход, миграция, вторжение, и метастазирование по среде белково-белковых взаимодействий во многих сигнальных путей1,12,13,14,15,16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16,151617, 18. Поэтому важно определить, что crk/CrkL-зависимые мигрирующие и инвазивные возможности раковых клеток. Анализ клеток в реальном времени был проведен для определения мигрирующих и инвазивных способностей клеток глиобластомы при подделке генов Crk и CrkL.
Этот метод документ описывает подробные измерения Crk- и CrkL-опосредованной миграции и вторжения клеток глиобластомы человека.
Измерение миграции и вторжения в реальном времени с использованием системы анализа ячеек в реальном времени представляет собой простой, быстрый и непрерывный процесс мониторинга с многочисленными значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами, предоставляя дан?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Оливию Фанк за техническую помощь в подготовке данных системы анализа ячеек в режиме реального времени. Мы также благодарим Медицинский центр письма в Детском Милосердии Канзас-Сити за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Томом Keaveny Наделенный Фонд детских исследований рака (TP) и Детские милосердия больницы Midwest рака Альянс Партнерский консультативный совет финансирования (TP).
Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |