Impedance основе в режиме реального времени Измерения миграции раковых клеток и вторжения
Summary
Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение способности раковых клеток мигрировать и вторгаться в различных условиях лечения имеет решающее значение для оценки терапевтических стратегий. Этот протокол представляет метод оценки метастатических способностей в реальном времени линии раковых клеток глиобластомы.
Abstract
Рак возникает из-за неконтролируемого распространения клеток, инициированных генетической нестабильностью, мутациями, а также экологическими и другими факторами стресса. Эти приобретенные аномалии в сложных, многослойных молекулярных сигнальных сетях вызывают аномальное пролиферацию и выживание клеток, внеклеточную деградацию матрицы и метастазирование в отдаленные органы. Приблизительно 90% случаев смерти, связанных с раком, по оценкам, вызваны прямыми или косвенными последствиями метастатического распространения. Поэтому важно создать высоконадежную, всеобъемлющую систему для характеристики поведения раковых клеток при генетических и экологических манипуляциях. Такая система может дать четкое представление о молекулярной регуляции метастазах рака и возможности для успешного развития стратифицированных, точных терапевтических стратегий. Таким образом, точное определение поведения раковых клеток, таких как миграция и вторжение с увеличением или потерей функции генов (ы) позволяет оценить агрессивный характер раковых клеток. Система измерений в реальном времени, основанная на клеточной импедании, позволяет исследователям постоянно получать данные в ходе всего эксперимента и мгновенно сравнивать и количественно оценивать результаты в различных экспериментальных условиях. В отличие от обычных методов, этот метод не требует фиксации, окрашивания и обработки образцов для анализа клеток, которые мигрируют или вторгаются. В этом методическом документе особое внимание уделяется подробным процедурам определения миграции и вторжения раковых клеток глиобластомы в режиме реального времени.
Introduction
Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение генотипов и фенотипов рака имеет решающее значение для понимания и разработки эффективных терапевтических стратегий. Десятилетия исследований рака привели к разработке и адаптации различных методов определения генотипов и фенотипов рака. Одним из последних технических разработок является измерение миграции и вторжения в реальном времени на основе клеточного импеданса. Сливки клеток к субстратам и контактам клеток играют важную роль в связи и регуляции, развитии и поддержании тканей. Аномалии в клеточной адгезии приводят к потере клеточного контакта, деградации внеклеточной матрицы (ECM) и приобретению мигрирующих и вторгающихся возможностей клетками, которые способствуют метастазам раковых клеток в различные органы1,2. Различные методы доступны для определения миграции клеток (заживление ран и Бойден камеры анализы) и вторжения (Matrigel-Boyden камеры анализ)3,4,5. Эти обычные методы являются полуколичественными, потому что клетки должны быть помечены флуоресцентным красителем или другими красителями до или после эксперимента для измерения фенотипов клеток. Кроме того, в некоторых случаях необходимы механические сбои для создания раны для измерения миграции клеток в место раны. Более того, эти существующие методы отнимают много времени, трудоемки и измеряют результаты только в одно время. Кроме того, эти методы склонны к неточным измерениям из-за непоследовательной обработки во время экспериментальной процедуры6.
В отличие от обычных методов, система анализа клеток в реальном времени измеряет клеточные импеданс в режиме реального времени, не требуя предварительного или постстождения и механического повреждения клеток. Что еще более важно, продолжительность эксперимента может быть продлена, с тем чтобы биологические эффекты могли определяться зависящим от времени образом. Выполнение эксперимента является эффективным по времени и не трудоемким. Анализ данных является относительно простым и точным. По сравнению с другими методами, этот метод является одним из лучших измерений в реальном времени для измерения миграции клеток и вторжения6,,77,8,,9.
Giaever и Keese были первыми, кто описал импеданс-измерение популяции клеток на поверхности электродов10. Система анализа клеток в реальном времени работает по тому же принципу. Площадь каждого микроплитного колодца составляет примерно 80% покрыто массивом золотых микроэлектродов. Когда площадь поверхности электрода занята клетками из-за присоединения или распространения клеток, электрический импульс меняется. Этот импеданс отображается как индекс клеток, который прямо пропорционален клеткам, покрывающим область поверхности электрода после того, как они проникают в микропористую мембрану (средний размер пор этой мембраны 8 мкм)11.
Crk и CrkL являются адаптерными белками, содержащими SH2 и SH3 домены и играют важную роль в различных клеточных функций, таких как цитоскелет регулирования, преобразование клеток, пролиферация, адгезия, эпителиал-мезенхимальный переход, миграция, вторжение, и метастазирование по среде белково-белковых взаимодействий во многих сигнальных путей1,12,13,14,15,16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16,151617, 18. Поэтому важно определить, что crk/CrkL-зависимые мигрирующие и инвазивные возможности раковых клеток. Анализ клеток в реальном времени был проведен для определения мигрирующих и инвазивных способностей клеток глиобластомы при подделке генов Crk и CrkL.
Этот метод документ описывает подробные измерения Crk- и CrkL-опосредованной миграции и вторжения клеток глиобластомы человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение миграции и вторжения в реальном времени с использованием системы анализа ячеек в реальном времени представляет собой простой, быстрый и непрерывный процесс мониторинга с многочисленными значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами, предоставляя дан?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Оливию Фанк за техническую помощь в подготовке данных системы анализа ячеек в режиме реального времени. Мы также благодарим Медицинский центр письма в Детском Милосердии Канзас-Сити за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Томом Keaveny Наделенный Фонд детских исследований рака (TP) и Детские милосердия больницы Midwest рака Альянс Партнерский консультативный совет финансирования (TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
