Impedansbaserad realtidsmätning av cancercellmigration och invasion
Summary
Cancer är en dödlig sjukdom på grund av dess förmåga att metastasera till olika organ. Att bestämma cancercellernas förmåga att migrera och invadera under olika behandlingsförhållanden är avgörande för att bedöma terapeutiska strategier. Detta protokoll presenterar en metod för att bedöma realtid ögonbevarande förmågor av en glioblastoma cancer cellinje.
Abstract
Cancer uppstår på grund av okontrollerad spridning av celler som initierats av genetisk instabilitet, mutationer och miljömässiga och andra stressfaktorer. Dessa förvärvade avvikelser i komplexa, flerskiktade molekylära signalering nätverk inducera avvikande cell spridning och överlevnad, extracellulära matris nedbrytning och metastasering till avlägsna organ. Cirka 90% av cancerrelaterade dödsfall beräknas orsakas av de direkta eller indirekta effekterna av metastaserande spridning. Därför är det viktigt att upprätta ett mycket tillförlitligt, omfattande system för att karakterisera cancercell beteenden på genetiska och miljömässiga manipulationer. Ett sådant system kan ge en tydlig förståelse för den molekylära regleringen av cancermetastaser och möjligheten till framgångsrik utveckling av stratifierade, exakta terapeutiska strategier. Därför, korrekt bestämning av cancer cell beteenden såsom migration och invasion med vinst eller förlust av funktion av gen (s) tillåter bedömning av den aggressiva karaktären av cancerceller. Realtidsmätningssystemet baserat på cellimpedans gör det möjligt för forskare att kontinuerligt inhämta data under ett helt experiment och omedelbart jämföra och kvantifiera resultaten under olika experimentella förhållanden. Till skillnad från konventionella metoder kräver den här metoden inte fixering, färgning och provbearbetning för att analysera celler som migrerar eller invaderar. Denna metod papper betonar detaljerade förfaranden för realtid bestämning av migration och invasion av glioblastoma cancerceller.
Introduction
Cancer är en dödlig sjukdom på grund av dess förmåga att metastasera till olika organ. Bestämma cancer genotyper och fenotyper är avgörande för att förstå och utforma effektiva terapeutiska strategier. Årtionden av cancerforskning har lett till utveckling och anpassning av olika metoder för att bestämma cancer genotyper och fenotyper. En av de senaste tekniska utvecklingen är realtidsmätning av cellmigration och invasion baserad på cellimpedans. Cellvidhäftning till substrat och cellcellkontakter spelar en viktig roll i cell-till-cell kommunikation och reglering, utveckling och underhåll av vävnader. Avvikelser i cellvidhäftning leder till förlust av cellcellkontakt, nedbrytning av extracellulär matris (ECM) och vinst av flyttande och invaderande förmåga av celler, som alla bidrar till metastasering av cancerceller till olika organ1,2. Olika metoder finns tillgängliga för att bestämma cellmigration (sårläkning och Boyden kammaranalyser) och invasion (Matrigel-Boyden kammare analys)3,4,5. Dessa konventionella metoder är semikvantitativa eftersom celler måste märkas med ett fluorescerande färgämne eller andra färgämnen antingen före eller efter experimentet för att mäta cellfenotyper. Dessutom behövs mekaniska störningar i vissa fall för att skapa ett sår för att mäta migrationen av celler till sårplatsen. Dessutom är dessa befintliga metoder tidskrävande, arbetsintensiva och mäter resultaten vid endast en tidpunkt. Dessutom är dessa metoder benägna att göra felaktiga mätningar på grund av inkonsekvent hantering under försöksproceduren6.
Till skillnad från konventionella metoder mäter cellanalyssystemet i realtid cellimpedans i realtid utan att kräva pre- eller poststaining och mekanisk skada av celler. Ännu viktigare är att varaktigheten av ett experiment kan förlängas så att biologiska effekter kan bestämmas på ett tidsberoende sätt. Att köra experimentet är tidseffektivt och inte arbetskrävande. Att analysera data är relativt enkelt och korrekt. Jämfört med andra metoder är denna metod en av de bästa realtidsmätningarna för att mäta cellmigrering och invasion6,,7,,8,9.
Giaever och Keese var de första att beskriva impedans-baserade mätning av en cellpopulation på ytan av elektroder10. Realtidscellanalyssystemet fungerar enligt samma princip. Området för varje mikroplåtsbrunn är cirka 80% täckt med en rad guldmikroelektroder. När elektrodens yta upptas av celler på grund av vidhäftning eller spridning av cellerna, ändras den elektriska impedansen. Denna impedans visas som cellindex, som är direkt proportionell mot de celler som täcker elektrodens yta efter att de trängt in i mikroporösa membranet (medianporstorleken på detta membran är 8 μm)11.
Crk och CrkL är adaptorproteiner som innehåller SH2- och SH3-domäner och spelar viktiga roller i olika cellulära funktioner, såsom cytoskeletonreglering, celltransformation, spridning, vidhäftning, epitel-mesenkymal övergång, migration, invasion och metastasering genom att medla protein-proteininteraktioner i många signalvägar1,,12,13, 14,14,15,16,17, 18.Den har inte till någon del av Därför är det viktigt att bestämma Crk/CrkL-beroende migrations- och invasiva förmåga att cancerceller. Realtid cell analys utfördes för att bestämma flyttande och invasiva förmågor glioblastoma celler på gen knockdown av Crk och CrkL.
Denna metod papper beskriver detaljerade mätningar av Crk- och CrkL-medierad migration och invasion av mänskliga glioblastoma celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Realtidsmätningen av cellmigration och invasion med hjälp av cellanalyssystemet i realtid är en enkel, snabb och kontinuerlig övervakningsprocess med flera, betydande fördelar jämfört med de traditionella metoderna som tillhandahåller data vid en enda tidpunkt. Som med de traditionella metoderna måste experimentella förhållanden optimeras för varje cellinje för cellanalyssystemet i realtid, eftersom varje cellinje kan vara olika när det gäller dess vidhäftning till substratet, tillväxt, cell-till-cell-ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Olivia Funk för hennes tekniska hjälp med realtidsdata för cellanalyssystem. Vi tackar också Medical Writing Center på Children’s Mercy Kansas City för att redigera detta manuskript. Detta arbete stöddes av Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (till TP) och av Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board finansiering (till TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
