내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도
Summary
우리는 두개골에 안정될 수 있는 끝에 바늘을 구부린, 따라서 근본적인 자렌치에 손상의 리스크를 제거하는 intracisternal 주입을 기술합니다. 이 접근법은 렙토메닝 세포의 유전적 운명 매핑 및 조작및 뇌척수액 이동 추적에 사용될 수 있습니다.
Abstract
여기에 설명된 프로토콜은 기본 자렌치마에 손상을 줄 위험을 제거하면서 시스터나 마그나를 통해 솔루션을 안전하고 수동으로 주입하는 방법을 설명합니다. 이전에 게시된 프로토콜은 경면에서 최대 1-2mm로 낮혀야 하는 직선 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 경막이 뚫리면 저항이 급격히 떨어지면 바늘을 일정한 위치에 유지하기가 어려워집니다. 우리의 방법은 대신, 두개골의 후두 뼈에 대해 안정화 될 수있는 끝에 바늘구부러진 바늘을 사용하여 주사기가 경막 의 천공 후 조직으로 침투하는 것을 방지합니다. 이 절차는 간단하고 재현 가능하며 수술 된 동물에게 오래 지속되는 불편 함을 일으키지 않습니다. 우리는 혈관 렙토메닝 세포의 유전 운명 매핑의 맥락에서 내분비증 주입 전략을 기술합니다. 동일한 기술은, 또한, 신경 발달에 있는 leptomeninges의 역할을 탐구하고 세균성 뇌막염의 퍼짐과 같은 광범위한 연구 질문을, 이러한 현상에 연루된 유전자의 유전 절제를 통해 이용될 수 있습니다. 또한, 절차는 일정한 납품을 위한 자동화된 주입 시스템과 결합되고 형광표지된 분자의 주입을 통해 뇌척수액 운동을 추적하는 데 이용될 수 있습니다.
Introduction
렙토메닝 세포는 뇌를 오버레이하고 콜라겐 가교(예를 들어, Dcn 및 Lum)에연루된 유전자를 표현하는 얇은 층으로 구성된 섬유아세포와 같은 세포 집단이며, 뇌-수막 장벽(예를 들어, Cldn11)1,,2. 렙토메닝 세포는 뇌척수액배수에 대한 엄격한 통제로부터 뇌의 발달 뇌에서 신경 전구체의 지도에 이르기까지 광범위한 생리 기능에 연루되어4,,5. 최근 연구는 또한 신생아에 있는 leptomeninges 두뇌 자영으로 이동하고 기능적인 피질 신경으로 발전하는 방사형 glia 같이 세포를 항구할 수 있다는 것을 제안했습니다6.
렙토메닝 세포는 표면 성상 세포에 근접하여 위치하며, 그들과 공유하며, 다른 실치형 천체, 코넥신-30(Cx30)의 발현도7. 아래에 설명된 외과 적 절차는 Cx30+ 세포에서 tdTomato를 조건부로 발현하는 형질전환 마우스의 시스터나 마그나로 엔도시펜의 일회성 전달을 통해 이러한 수막 세포의 광범위하고 구체적인 라벨링을 허용합니다 (즉, 운명 매핑을 위한 CreER-loxP 시스템을 사용하여). 엔도시펜은 타목시펜의 활성 대사 산물이며 타목시펜과 같은 방식으로 CreER 발현 세포의 재조합을 유도합니다. 그러나 고농도의 에탄올 대신 5-10% DMSO에 용해되기 때문에 국소 적용에 권장되는 솔루션입니다. 추가적으로, endoxifen는 두뇌 수막 장벽을 교차하지 않으며, 그것으로 근본적인 Cx30+ 천체 집단의 표지 없이 렙토메닝 세포의 특정 재조합을 가능하게 합니다 (대표 결과참조).
여기에 제시 된 기술은 수동으로 안전하게 시스터나 마그나에 직접 액세스를 통해 뇌척수액에 화합물을 주입하는 것을 목표로합니다. 다른 달리, 개두술을 필요로 하는 더 침략적인 절차, 이 접근은 두개골 또는 두뇌 sarenchyma에 손상을 일으키는 원인이 되지 않고 화합물을 주입하는 것을 허용합니다. 따라서, 그것은 실화 신경교 세포의 활성화에 의해 유발 된 염증 반응의 유도와 연관되지 않습니다. 8,9,910이전에 설명된 다른 주사전략과유사하게, 본 접근법은 목 근육을 둔하게 해부한 후, 시스터나 마그나를 덮는 아틀란토 후두막의 외과적 노출에 의존한다. 그러나 다른 절차와 달리 투여 중 후두 뼈에 대해 안정화 될 수있는 팁에 바늘을 구부려 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 바늘이 너무 깊게 관통하고 근본적인 소뇌 및 수질손상을 손상하는 리스크를 방지할 것입니다.
이 외과 적 절차는 실치층을 통해 세포 정체성 및 마이그레이션 경로의 변화를 매핑하는 것을 목표로 하는 계보 추적 조사와 호환됩니다. 또한 피질 발달에 대한 그들의 기여또는 세균성 뇌막염의 확산과 같은 건강과 질병에서 렙토메닝 세포의 역할을 탐구하려는 유전적 절제 연구에 적응될 수 있다33,11.5 마지막으로, 야생형 동물의 형광 추적자의 전달과 결합될 때 뇌척수액 의 움직임을 추적하는 데 활용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 운명 매핑을 위해 렙토메닝 세포에 레이블을 지정하는 간단하고 재현 가능한 절차를 제시합니다. 우리는 Tx30-CreER에서 tdTomato 형광 리포터의 발현을 유도하기 위해 타목시펜의 활성 대사 산물인 엔독시펜의 내성 분사술을 사용합니다. R26R-tdTomato 마우스12,,13.
시스터나 마그나9를통해 뇌척…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴 암 학회, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단, 너트 오크 앨리스 발렌 베르첼스와 카롤린스카 연구소에서 줄기 세포와 재생 의학의 전략적 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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