Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal
Summary
Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.
Abstract
El protocolo descrito aquí describe cómo inyectar soluciones de forma segura e manual a través de la cisterna magna, al tiempo que se elimina el riesgo de daño al parénquima subyacente. Los protocolos publicados anteriormente recomiendan el uso de agujas rectas que deben reducirse a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura. La caída repentina de la resistencia una vez perforada la membrana dura hace que sea difícil mantener la aguja en una posición estable. Nuestro método, en cambio, emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar contra el hueso occipital del cráneo, evitando así que la jeringa penetre en el tejido después de la perforación de la membrana dural. El procedimiento es sencillo, reproducible y no causa molestias duraderas en los animales operados. Describimos la estrategia de inyección intracisternal en el contexto de la cartografía genética del destino de las células leptomeningeales vasculares. La misma técnica puede, además, utilizarse para abordar una amplia gama de cuestiones de investigación, como el sondeo del papel de los leptomeninges en el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana, a través de la ablación genética de genes implicados putativamente en estos fenómenos. Además, el procedimiento se puede combinar con un sistema de perfusión automatizado para un parto constante y se utiliza para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo a través de la inyección de moléculas etiquetadas fluorescentesmente.
Introduction
Las células leptomeningeales son una población similar a los fibroblastos de células organizadas en una capa delgada que superpone el cerebro y expresa genes implicados en la reticulación de colágeno (por ejemplo, Dcn y Lum),y en el establecimiento de una barrera cerebro-meningeal (por ejemplo, Cldn11)1,2. Las células leptomeningeales están implicadas en una amplia gama de funciones fisiológicas, desde un estricto control sobre el drenaje del líquido cefalorraquídeo3 hasta la guía de progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo4,5. Un estudio reciente también ha propuesto que los leptomeninges en el recién nacido pueden albergar células radiales similares a la glia que migran al parénquima cerebral y se convierten en neuronas corticales funcionales6.
Las células leptomeningeales se encuentran muy cerca de los astrocitos de superficie y comparten con ellos, así como otras astroglia parenquimales, expresión de connexina-30 (Cx30)7. El procedimiento quirúrgico descrito a continuación permite un etiquetado generalizado y específico de estas células meningeales a través de una entrega única de endoxifeno en la cisterna magna de ratones transgénicos que expresan condicionalmente tdTomato en Cx30+ células (es decir, utilizando un sistema CreER-loxP para la cartografía del destino). Endoxifeno es un metabolito activo de tamoxifeno e induce la recombinación de células que expresan CreER de la misma manera que el tamoxifeno. Es, sin embargo, la solución recomendada para la aplicación tópica porque se disuelve en 5-10% DMSO, en lugar de altas concentraciones de etanol. Además, el endoxifeno no cruza la barrera cerebro-meningeal, lo que permite una recombinación específica de células leptomeningeales, sin etiquetado de la población subyacente Cx30+ astroglial (ver Resultados Representativos).
La técnica presentada aquí tiene como objetivo inyectar manual y segura mente el compuesto en el líquido cefalorraquídeo, a través del acceso directo a la cisterna magna. A diferencia de otros procedimientos más invasivos que requieren craneotomía, este enfoque permite infundir compuestos sin causar daño al cráneo o al parénquima cerebral. Por lo tanto, no se asocia con la inducción de reacciones inflamatorias desencadenadas por la activación de células de la glia parenquimal. Similar a otras estrategias de inyección descritas antesde 8,9,10, el enfoque actual se basa en la exposición quirúrgica de la membrana dural atlanto-occipital que cubre la cisterna magna, después de la disección contundente de los músculos del cuello superpuestos. Sin embargo, a diferencia de otros procedimientos, recomendamos el uso de una aguja doblada en la punta, que se puede estabilizar contra el hueso occipital durante la administración. Esto evitará el riesgo de que la aguja penetre demasiado profundo y dañe el cerebelo subyacente y la médula.
Este procedimiento quirúrgico es compatible con las investigaciones de rastreo de linaje que apuntan a mapear los cambios en las identidades celulares y las rutas de migración a través de capas parénquimas. También se puede adaptar a estudios de ablación genética que pretenden investigar el papel de las células leptomeningeales en la salud y la enfermedad, como su contribución al desarrollo cortical5 o la propagación de la meningitis bacteriana3,11. Finalmente, se puede utilizar para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo cuando se combina con la entrega de marcadores fluorescentes en animales de tipo salvaje.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento sencillo y reproducible para etiquetar células leptomeningeal es para la cartografía del destino. Utilizamos la inyección intracisternal de endoxifeno, un metabolito activo de tamoxifeno, para inducir la expresión del reportero fluorescente tdTomato en Cx30-CreER; R26R-tdTomato ratones12,13.
En comparación con otros protocolos utilizados para acceder al líquido cefalorraquíde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad Sueca contra el Cáncer, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse y el Programa de Investigación Estratégica en Células Madre y Medicina Regenerativa en Karolinska Institutet (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
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