Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal
Summary
Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.
Abstract
O protocolo aqui descrito descreve como injetar soluções com segurança e manualmente através da cisterna magna, eliminando o risco de danos ao parnchyma subjacente. Protocolos publicados anteriormente recomendam o uso de agulhas retas que devem ser reduzidas a um máximo de 1-2 mm da superfície dural. A queda repentina da resistência uma vez perfurada a membrana dural dificulta a manutenção da agulha em posição constante. Nosso método, em vez disso, emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada contra o osso occipital do crânio, impedindo assim que a seringa penetre no tecido após perfuração da membrana dural. O procedimento é simples, reproduzível e não causa desconforto duradouro nos animais operados. Descrevemos a estratégia de injeção intracisternal no contexto do mapeamento do destino genético das células leptomenínias vasculares. A mesma técnica pode, além disso, ser utilizada para abordar uma ampla gama de questões de pesquisa, como sondar o papel das leptomeninges no neurodesenvolvimento e a disseminação da meningite bacteriana, através da ablação genética de genes putativamente implicados nesses fenômenos. Além disso, o procedimento pode ser combinado com um sistema de infusão automatizado para uma entrega constante e usado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano através da injeção de moléculas rotuladas fluorescentes.
Introduction
As células leptomeningeais são uma população de células semelhantes ao fibroblasto organizadas em uma camada fina sobrepondo o cérebro e expressando genes implicados na crosslinking de colágeno (por exemplo, Dcn e Lum),e no estabelecimento de uma barreira cérebro-meningeal (por exemplo, Cldn11)1,2. As células leptomenínias estão implicadas em uma ampla gama de funções fisiológicas, desde o controle rigoroso sobre a drenagem do fluido cefalorraquidiano3 até a orientação de progenitores neurais no cérebro em desenvolvimento4,5. Um estudo recente também propôs que as leptomeninges no recém-nascido podem abrigar células radiais semelhantes à glia que migram para o parênquima cerebral e se desenvolvem em neurônios corticais funcionais6.
As células leptomenínias estão localizadas próximas aos astrócitos superficiais e compartilham com elas, assim como outras astroglias parênquias, expressão de connexin-30 (Cx30)7. O procedimento cirúrgico descrito abaixo permite a rotulagem generalizada e específica dessas células meningeais através de uma entrega única de endoxifen na cisterna magna de camundongos transgênicos expressando condicionalmente tdTomato em células Cx30+ (ou seja, usando um sistema CreER-loxP para mapeamento do destino). O endoxifen é um metabólito ativo do Tamoxifen e induz a recombinação de células expressas por CreER da mesma forma que o Tamoxifen. É, no entanto, a solução recomendada para aplicação tópica porque se dissolve em 5-10% DMSO, em vez de altas concentrações de etanol. Além disso, o endoxifen não atravessa a barreira cérebro-meningeal, permitindo assim uma recombinação específica de células leptomeningeais, sem rotular a população cx30+ astroglial subjacente (ver Resultados Representativos).
A técnica aqui apresentada visa injetar manual e seguramente o composto no fluido cefalorraquidiano, via acesso direto à cisterna magna. Ao contrário de outros procedimentos mais invasivos que requerem craniotomia, esta abordagem permite infundir compostos sem causar danos ao crânio ou ao parequima cerebral. Assim, não está associada à indução de reações inflamatórias desencadeadas pela ativação de células glia parenquiais. Semelhante a outras estratégias de injeção descritas antesde 8,9,10, a abordagem presente baseia-se na exposição cirúrgica da membrana dural atlanto-occipital que cobre a cisterna magna, após dissecção contundente dos músculos do pescoço sobreposto. No entanto, ao contrário de outros procedimentos, recomendamos o uso de uma agulha dobrada na ponta, que pode ser estabilizada contra o osso occipital durante a administração. Isso evitará que a agulha penetre muito fundo e prejudique o cerebelo subjacente e a medula.
Este procedimento cirúrgico é compatível com investigações de rastreamento de linhagem que visam mapear mudanças nas identidades celulares e rotas migratórias através de camadas parêmicas. Também pode ser adaptado a estudos de ablação genética que pretendem sondar o papel das células leptomeningeais na saúde e na doença, como sua contribuição para o desenvolvimento cortical5 ou a disseminação da meningite bacteriana3,11. Finalmente, pode ser utilizado para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano quando combinado com a entrega de rastreadores fluorescentes em animais do tipo selvagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito apresenta um procedimento simples e reprodutível para rotular células leptomeningeais para mapeamento do destino. Utilizamos injeção intracisternal de endoxifen, um metabólito ativo de Tamoxifen, para induzir a expressão do repórter fluorescente tdTomato em Cx30-CreER; Ratos R26R-tdTomato12,13.
Em comparação com outros protocolos usados para obter acesso ao fluido cefalorraquidiano através da cistern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Sueco de Pesquisa, da Sociedade Sueca de Câncer, da Fundação Sueca de Pesquisa Estratégica, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e do Programa de Pesquisa Estratégica em Células-Tronco e Medicina Regenerativa do Instituto Karolinska (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
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