الفلورسنت المناعية من البروتينات و البكتينات أرابينغالات في جدار الخلية من الأنسجة النباتية
Summary
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.
Abstract
ويشمل تطوير النبات تعديلات ثابتة على تكوين جدار الخلية وهيكلها استجابة للمحفزات الداخلية والخارجية على حد سواء. وتتألف جدران الخلايا من السليلوز وغير السليلوزية السكريات جنبا إلى جنب مع البروتينات والمركبات الفينولية والماء. يتكون 90٪ من جدار الخلية من السكريات (مثل البكتين) وبروتينات أرابينوغالكاتا (AGPs). يبقى تحديد مكان المناعة الفلورية من أسطح جليكان محددة في أقسام النسيج النباتية أداة رئيسية للكشف عن إعادة عرض الشبكات السكاريد الجدار، والهيكل والمكونات.
هنا، نحن الإبلاغ عن إجراء تحسين المناعة الفلورية للكشف عن epitopes الجليكان من AGPs والبكتين في الأنسجة النباتية. وقد استخدم تثبيت Paraformaldehyde/glutaraldehyde جنبا إلى جنب مع LR-White تضمين عينات النبات، مما يسمح للحفاظ على نحو أفضل من بنية الأنسجة وتكوينها. واستخدمت أجزاء رقيقة من العينات المضمنة التي تم الحصول عليها مع microtome فائقة لlocalization المناعة مع الأجسام المضادة محددة. هذه التقنية تقدم دقة كبيرة، وخصوصية عالية، وفرصة للكشف عن عدة ظهارات الجليكان في نفس العينة. هذه التقنية تسمح توطين دون الخلية من الجليكان ويكتشف مستوى تراكمها في جدار الخلية. كما يسمح بتحديد الأنماط الزقتية -الزمنية لتوزيع البكتين و البكتين أثناء العمليات التطويرية. استخدام هذه الأداة قد توجه في نهاية المطاف اتجاهات البحوث وربط الجليكانات لوظائف محددة في النباتات. وعلاوة على ذلك، يمكن للمعلومات التي تم الحصول عليها أن تكمل الدراسات الكيميائية الحيوية ودراسات التعبير الجيني.
Introduction
جدران الخلايا النباتية هي هياكل معقدة تتألف من السكريات وبروكرينات الجليكو. جدران الخلية هي هياكل ديناميكية للغاية التي تختلف هندستها التنظيمية ، والتنظيم والتركيب وفقا لنوع الخلية ، والتوطين ، ومرحلة التنمية ، ومحفزات خارجية وداخلية1. تعتبر بروتينات أرابينوغالات (AGPs) والبكتين مكونات مهمة من جدار الخلايا النباتية. إن البروتينات والجليكوسيلات عالية البيرة والبكتين هي السكاريدات المثلية التي تختلف تكوينها وكميتها وبنيتها اختلافاً كبيراً خلال مراحل نمو النباتات المختلفة2،3،4. وقد كشفت الدراسات AGPs والبكتين مشاركتهم في العديد من العمليات النباتية مثل موت الخلايا المبرمجة، والاستجابة للضغوط اللاأحيائية، والتكاثر النباتي الجنسي، من بين أمور أخرى كثيرة5. وقد بدأت معظم هذه الدراسات بمعلومات تم الحصول عليها من دراسات نقل المناعة.
ونظرا لتعقيدها، فإن دراسة جدران الخلايا تتطلب العديد من الأدوات المختلفة. الكشف عن الظهارات الجليكان باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هو نهج قيم لحل توزيع السكرياتيدات وجليكوبروتين على طول هذا الهيكل. هناك مجموعة كبيرة من mAbs المتاحة للكشف عن epitopes الجليكان ويتم تحسين خصوصية كل ماب بشكل مستمر وكذلك6. التقنية الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على جميع أنواع النباتات، وهي أداة مثالية لتوجيه اتجاهات البحث المستقبلية التي قد تنطوي على تقنيات أكثر تكلفة وتعقيدا.
في هذه التقنية، يتم الاقتران مع أجسام مضادة محددة كيميائيا لأصباغ الفلورسنت مثل FITC (الفلوريسين ايزوثيوسانات)، TRITC (tetramethylrhodamine-5-(و 6)-isothiocyanate) أو عدة صبغات فلور اليكسا. يوفر الفلورسينت العديد من المزايا، مما يسمح بتعريب الخلايا دون الخلوية الواضحة والسريعة للجليكانات التي يمكن ملاحظتها مباشرة تحت مجهر الفلورانس. وهو محدد وحساس للغاية ، لأن إعداد العينة يمكن أن يحمي بشكل فعال الهيكل الطبيعي للمستضد ، حتى لو كان موجودًا بكميات أقل. فإنه يسمح للكشف عن مستضدات متعددة في نفس العينة والأهم من ذلك، ويقدم جودة عالية ونتائج جميلة بصريا. على الرغم من القوة العظمى التي تقدمها دراسات تحديد المواقع المناعية المفلورة ، فإنها غالبا ما تعتبر صعبة الأداء والتنفيذ على الأرجح بسبب عدم وجود بروتوكولات مفصلة تسمح بالتصور من مختلف خطوات الإجراء. هنا، ونحن نقدم بعض المبادئ التوجيهية البسيطة حول كيفية تنفيذ هذه التقنية وكيفية الحصول على صور ذات جودة عالية.
بالنسبة للبروتوكول المقدم هنا، يجب أولاً إصلاح العينات وإضمانها باستخدام المثبت الأكثر ملاءمة. على الرغم من اعتبارها تقنية مستهلكة للوقت ومملة نسبيًا ، فإن التثبيت السليم وتضمين عينة النبات هو المفتاح لضمان إجراء فحص مناعي ناجح. لهذا الغرض، فإن الأكثر شيوعا هو تثبيت المواد الكيميائية باستخدام المثبتات عبر الربط، مثل الألدهيدات. المثبتات المتبادلة الربط إنشاء الروابط الكيميائية بين جزيئات الأنسجة، وتحقيق الاستقرار وتصلب العينة. الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد هي عبر ربط المثبتات، وأحيانا يتم استخدام مزيج من كل من المثبتات7. الفورمالديهايد يقدم الحفاظ الهيكلية كبيرة من الأنسجة لفترات طويلة من الزمن، وإنتاج تراجع الأنسجة الصغيرة ويجري متوافقة مع المناعة. الجلثارالدهيد هو تثبيت أقوى ومستقرة تستخدم عادة في تركيبة مع الفورمالديهايد. استخدام الجلوتارالدلديهايد لديه بعض العيوب التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لأنه يقدم بعض المجموعات الألدهيد الحرة في الأنسجة الثابتة, التي قد تولد بعض العلامات غير محددة. أيضا الربط بين البروتينات والجزيئات الأخرى في بعض الأحيان قد تجعل بعض epitopes الهدف لا يمكن الوصول إليها للأجسام المضادة. لتجنب هذا، يجب تحديد كمية ومدة التثبيت بعناية.
بعد التثبيت، يتم تضمين عينات في الراتنج السليم لتصلب قبل الحصول على أقسام. لندن الراتنج (LR-الأبيض) الراتنج الاكريليك هو الراتنج المفضل لدراسات تخصيص المناعة. على عكس راتنجات أخرى، LR-White هو ماء، مما يسمح للأجسام المضادة للوصول إلى المستضدات الخاصة بهم، مع عدم الحاجة إلى أي علاج لتسهيل ذلك. LR-White لديها أيضا ميزة تقديم انخفاض فلورا لصناعة السيارات، مما يسمح للحد من الضوضاء الخلفية أثناء تصوير المناعة.
هناك العديد من تقنيات التلطيخ المتاحة للكشف عن مكونات مختلفة من جدار الخلية، مثل تلطيخ الأزرق ألسيان، تلطيخ الأزرق التلوويدين أو حمض الدورية شيف (PAS) تلطيخ. لا شيء من هذه تقدم قوة تحليل تخصيص المناعة8. هذا النهج يعطي قدرا أكبر من التحديد في الكشف عن الجليكان، وتقديم معلومات أوسع بشأن تكوين جدار الخلية وهيكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تحديد المواقع المناعية الفلورية في النباتات الموصوفة هنا ، في حين أنها واضحة بسلاسة ، تعتمد على نجاح العديد من الخطوات الصغيرة. الأول منها هو إعداد العينة واللصلح. خلال هذه الخطوة الأولى، يتم استخدام مزيج من الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد لتقاطع التشابك غالبية مكونات الخلية. يوفر …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى المؤلفون الدعم من مشروع الاتحاد الأوروبي 690946 ‘SexSeed’ (الاستنساخ النباتي الجنسي – تكوين البذور) الممول من H2020-MSCA-RISE-2015 وSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. تلقى مشروع AMP منحة من مشروع MSCA-IF-2016 التابع للاتحاد الأوروبي (رقم 753328). تلقت MC منحة من منحة دكتوراه FCT SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
