植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化
Summary
このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。
Abstract
植物の開発には、内部および外部刺激の両方に応答して、細胞壁の組成と構造の一定の調整が含まれます。細胞壁は、タンパク質、フェノール化合物および水と共にセルロースおよび非セルロース性多糖類で構成されています。細胞壁の90%は、多糖類(例えば、ペクチン)およびアラビノガラクタンタンパク質(AMP)で構成されています。植物組織学的セクションにおける特定のグリカンエピトープの蛍光免疫局在化は、壁多糖ネットワーク、構造および構成要素のリモデリングを明らかにする重要なツールであり続けています。
ここでは、植物組織中のAMPおよびペクチンからグリカンエピトープを検出するための最適化された蛍光免疫局在化手順を報告する。パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定は、植物サンプルのLR-White埋め込みと一緒に使用され、組織構造および組成のより良い保存を可能にする。超ミクロトームで得られた埋め込みサンプルの薄い部分は、特定の抗体による免疫局在化に使用された。この手法は、大きな解像度、高い特異性、および同じサンプル内の複数のグリカンエピトープを検出する機会を提供します。この技術は、グリカンの細胞内局在化を可能にし、細胞壁に蓄積のレベルを検出します。また、発達過程におけるAGPおよびペクチン分布の時空間的パターンの決定も可能となる。このツールの使用は、最終的に研究の方向を導き、植物の特定の機能にグリカンをリンクすることができます。さらに、得られた情報は、生化学的および遺伝子発現研究を補完することができる。
Introduction
植物細胞壁は、多糖類と糖タンパク質から構成される複雑な構造です。細胞壁は、そのアーキテクチャ、組織および構成が細胞の種類、局在化、発達段階、外部および内部刺激によって異なる非常に動的な構造である 1.アラビノガラクタンタンパク質(AMP)およびペクチンは、植物細胞壁の重要な構成要素である。AGPは、高グリコシル化タンパク質およびペクチンは、その組成、量および構造が異なる植物の発生段階2、3、4の間に大きく変化するホモガラクチュロン多糖である。ASPおよびペクチン研究は、プログラムされた細胞死、無生物性ストレスへの応答、性植物の生殖、他の多くの間でのいくつかの植物プロセスへの関与を明らかにした5。これらの研究のほとんどは、免疫局在性研究から得られた情報から始まりました。
その複雑さを考えると、細胞壁の研究には多くの異なるツールが必要です。モノクローナル抗体(mAbs)を用いたグリカンエピトープの検出は、この構造に沿った多糖類および糖タンパク質分布を解決するための貴重なアプローチです。グリカンエピトープを検出するために利用可能なmAbsの大規模なコレクションがあり、各mAbの特異性は6と同様に継続的に改善されている。ここで説明する技術はすべての植物種に適用可能であり、より高価で複雑な技術を伴うかもしれない将来の研究の方向性を導くのに最適なツールです。
この技術では、特定の抗体は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)、TRITC(テトラメチルローダミン-5-(および6)-イソチオシアネート)またはいくつかのアレクサフルオール染料などの蛍光色素に化学的に結合されます。免疫蛍光は、蛍光顕微鏡下で直接観察することができるグリカンの明確かつ迅速な細胞内局在化を可能にするいくつかの利点を提供する。それは、高い特異的かつ感受性であり、試料の調製は、より少量で存在する場合であっても、抗原の自然な構造を効果的に保護することができるので。それは同じサンプルの複数の抗原の検出を可能にし、最も重要な、高品質および視覚的に美しい結果を提供する。蛍光免疫局在化研究によって提供される大きな力にもかかわらず、彼らはしばしば、手順の異なるステップの視覚化を可能にする詳細なプロトコルの欠如のために、実行し、実装することが困難であると考えられている。ここでは、この手法を実行する方法と高品質の画像を取得する方法について、いくつかの簡単なガイドラインを提供します。
ここで示すプロトコルの場合、サンプルはまず修正され、最も適切な固定を使用して埋め込む必要があります。時間がかかり、比較的面倒な技術と考えられていますが、植物試料の適切な固定と埋め込みは、免疫局在アッセイを成功させるための鍵です。この目的のために、最も通常はアルデヒドのような架橋固定剤を用いた化学固定である。架橋固定剤は、組織の分子間の化学的結合を確立し、サンプルを安定化し硬化させる。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、架橋性固定剤であり、そして時々両方の固定剤の混合が7を使用する。ホルムアルデヒドは、組織の構造保存を大きくし、長期間にわたって、小さな組織の引き込みと免疫染色との互換性を提供します。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと組み合わせて通常使用される、より強力で安定した固定剤です。グルタルアルデヒドの使用は、いくつかの自由なアルデヒド基を固定組織に導入し、非特異的標識を生成する可能性があるため、考慮しなければならないいくつかの欠点を有する。また、タンパク質と他の分子との架橋は、時折、抗体に対してアクセスできない標的エピトープをレンダリングする可能性があります。これを回避するには、固定の数量と期間を慎重に定義する必要があります。
固定後、サンプルは、セクションを得る前に硬化するために適切な樹脂に埋め込まれます。ロンドン樹脂(LR-白)アクリル樹脂は、免疫局在性試験に適した樹脂です。他の樹脂とは異なり、LR-Whiteは親水性であり、抗体が抗原に到達することを可能にし、それを容易にする治療を必要としない。LR-Whiteは低い自己蛍光を提供する利点もあり、免疫蛍光イメージング中のバックグラウンドノイズの低減を可能にする。
アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、周期酸-シッフ(PAS)染色など、細胞壁の異なる成分を検出するために利用可能な多くの染色技術があります。これらのどれも免疫局在性分析の力を提供していません8.このアプローチは、グリカンの検出に大きな特異性を与え、細胞壁の構成と構造に関するより広大な情報を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する植物における蛍光免疫局在化法は、シームレスに簡単に説明する一方で、いくつかの小さなステップの成功に依存しています。最初のサンプル調製と固定です。この最初のステップでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合物が細胞成分の大部分を架橋するために使用されます。溶液中のホルムアルデヒドは、グルタルアルデヒドが強いより永続的な結合を提供し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、H2020-MSCA-RISE-2015およびSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017が資金を提供するEUプロジェクト690946’SexSeed'(性植物生殖–種子形成)から支援を受けた。AMPは、欧州連合(EU)のMSCA-IF-2016プロジェクト(No. 753328)から助成金を受けました。MCはFCT PhD助成金SFRH/BD/111781/2015から助成金を受けました。
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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