Fluorescerende immunlokalisering av arabinogalaktane proteiner og pektiner i celleveggen av plantevev

Summary

Denne protokollen beskriver i detalj hvordan plantematerialet for immunolokalisering av arabinogalaktane proteiner og pektiner er fast, innebygd i en hydrofil akrylharpiks, seksjonert og montert på glasssklier. Vi viser celleveggrelaterte epitoper vil bli oppdaget med spesifikke antistoffer.

Abstract

Planteutvikling innebærer konstante justeringer av celleveggsammensetningen og strukturen som svar på både interne og eksterne stimuli. Cellevegger består av cellulose og ikke-cellulosiske polysakkarider sammen med proteiner, fenoliske forbindelser og vann. 90% av celleveggen består av polysakkarider (f.eks. pektiner) og arabinogalaktanproteiner (AgPs). Den fluorescerende immunolokaliseringen av spesifikke glykole epitoper i plante histologiske seksjoner er fortsatt et viktig verktøy for å avdekke ombygging av veggpolysakkaridnettverk, struktur og komponenter.

Her rapporterer vi en optimalisert fluorescerende immunolokaliseringsprosedyre for å oppdage glykole epitoper fra AgPs og pektiner i plantevev. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fiksering ble brukt sammen med LR-White innebygging av planteprøvene, noe som gir bedre bevaring av vevsstrukturen og sammensetningen. Tynne deler av de innebygde prøvene oppnådd med en ultramikrotom ble brukt til immunolokalisering med spesifikke antistoffer. Denne teknikken gir god oppløsning, høy spesifisitet, og muligheten til å oppdage flere glykole epitoper i samme prøve. Denne teknikken tillater subcellulær lokalisering av glykomaner og oppdager deres akkumuleringsnivå i celleveggen. Det tillater også bestemmelse av spatio-temporale mønstre av AGP og pektindistribusjon under utviklingsprosesser. Bruken av dette verktøyet kan til slutt veilede forskningsretninger og knytte glyanser til bestemte funksjoner i planter. Videre kan informasjonen som er innhentet utfylle biokjemiske og genuttrykksstudier.

Introduction

Plantecellevegger er komplekse strukturer som består av polysakkarider og glykoproteiner. Cellevegger er ekstremt dynamiske strukturer hvis arkitektur, organisering og sammensetning varierer i henhold til celletype, lokalisering, utviklingsstadium, ytre og interne stimuli¹. Arabinogalactan proteiner (AgPs) og pektiner er viktige komponenter i plantecelleveggen. AgPs er svært glykosylert proteiner og pektiner er homogalacturonan polysakkarider hvis sammensetning, mengde og struktur varierer sterkt under ulike planteutviklingsstadier^2,3,4. AgPs og pektin studier har avslørt deres engasjement i flere planteprosesser som programmert celledød, respons på abiotiske påkjenninger, seksuell plantegjengivelse, blant mange andre⁵. De fleste av disse studiene startet med informasjon hentet fra immunolokaliseringsstudier.

Gitt sin kompleksitet krever studiet av cellevegger mange forskjellige verktøy. Påvisning av glykole epitoper ved hjelp av monoklonale antistoffer (mAbs) er en verdifull tilnærming for å løse polysakkarid og glykoproteindistribusjon langs denne strukturen. Det er en stor samling av mAbs tilgjengelig for å oppdage glykol epitoper og spesifisiteten til hver mAb blir kontinuerlig forbedret samt⁶. Teknikken som er beskrevet er gjeldende for alle plantearter, og er et perfekt verktøy for å veilede fremtidige forskningsretninger som kan innebære dyrere og komplekse teknikker.

I denne teknikken er spesifikke antistoffer kjemisk konjugert til fluorescerende fargestoffer som FITC (fluoresceinisotyocyanat), TRITC (tetrametylrhodamine-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor fargestoffer. Immunofluorescens gir flere fordeler, slik at en klar og rask subcellulær lokalisering av glykoler som kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er svært spesifikt og følsomt, siden utarbeidelsen av prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selv om det er tilstede i lavere mengder. Det gjør det mulig å oppdage flere antigener i samme prøve og viktigst, gir høy kvalitet og visuelt vakre resultater. Til tross for den store kraften som tilbys av fluorescens immunolocalization studier, de er ofte ansett som vanskelig å utføre og implementere mest sannsynlig på grunn av mangel på detaljerte protokoller slik at visualisering av de ulike trinnene i prosedyren. Her gir vi noen enkle retningslinjer for hvordan du utfører denne teknikken og hvordan du får bilder av høy kvalitet.

For protokollen som presenteres her, må prøvene først festes og bygges inn ved hjelp av det mest hensiktsmessige fikseringsmiddelet. Selv om det anses som en tidkrevende og relativt kjedelig teknikk, er riktig fiksering og innebygging av planteprøven nøkkelen for å sikre en vellykket immunolokaliseringsanalyse. For dette formålet er den vanligste kjemisk fiksering ved hjelp av kryssbindingsfikser, som aldehyder. Kryssbindingsfikser etablerer kjemiske bindinger mellom molekyler i vevet, stabiliserer og herder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krysskoblingsfikser, og noen ganger brukes en blanding av begge fikseringsmidler⁷. Formaldehyd tilbyr stor strukturell bevaring av vev og i lengre perioder, produserer små vev tilbaketrekking og være kompatibel med immunstaining. Glutaraldehyd er et sterkere og stabilt fikseringsmiddel som vanligvis brukes i kombinasjon med formaldehyd. Bruken av glutaraldehyd har noen ulemper som må tas i betraktning som det introduserer noen gratis aldehyd grupper i fast vev, som kan generere noen uspesifik merking. Også krysskobling mellom proteiner og andre molekyler av og til kan gjøre noen mål epitoper utilgjengelige for antistoffene. For å unngå dette må antallet og varigheten av fikseringen defineres nøye.

Etter fiksering er prøver innebygd i riktig harpiks for å herde før de får delene. London Harpiks (LR-White) akrylharpiks er harpiks av valget for immunolokalisering studier. I motsetning til andre harpikser er LR-White hydrofil, slik at antistoffene kan nå sine antigener, uten behov for behandling for å lette det. LR-White har også fordelen av å tilby lav auto-fluorescens, slik at en reduksjon i bakgrunnsstøy under immunofluorescensavbildning.

Det er mange farging teknikker tilgjengelig for å oppdage ulike komponenter i celleveggen, for eksempel Alcian blå flekker, toluidin blå flekker eller periodisk syre-Schiff (PAS) farging. Ingen av disse tilbyr kraften i immunlokaliseringsanalyser⁸. Denne tilnærmingen gir større spesifisitet i påvisning av glykomaner, og tilbyr større informasjon om celleveggsammensetning og struktur.

Protocol

1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-hvit innebygging Fiksering og dehydreringMERK: Fikseringsprosessen er avgjørende for å bevare prøven. ved å kryssbinde molekyler stoppes cellulær metabolisme, noe som sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusjon. Fikseringsmidler og konsentrasjonen som brukes må justeres til dette formålet, slik at antigenene er tilstrekkelig utsatt for å samhandle med antistoffene. Følgende protokoll kombinerer den milde fikseri…

Representative Results

I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistoffet spesifikt finne plasseringen av den spesifikke epitopen i lys grønn, på en konsekvent måte, noe som åpner for karakterisering av celleveggsammensetningen på et bestemt utviklingsstadium av cellen, vevet eller organet. For eksempel LM6 antistoffet har en høy affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan som kan bli funnet rikelig merking celleveggen av den utviklende Quercus suber anther (Figur 2A),</st…

Discussion

Den fluorescerende immunolokaliseringsmetoden i planter her beskrevet, mens det er sømløst enkelt, er avhengig av suksessen til flere små trinn. Den første av disse er prøveforberedelse og fiksering. I løpet av dette første trinnet brukes en blanding av formaldehyd og glutaraldehyd til å kryssbinde flertallet av cellekomponentene. Formaldehyd i løsningen gir en mild og reversibel fiksering mens glutaraldehyd gir en sterk mer permanent kobling; balansen mellom de to fikseringene gir riktig mengde kryssbinding, sl…

Materials

25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)