Fluorescerande immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner i växtvävnadernas cellvägg

Summary

Detta protokoll beskriver i detalj hur växtmaterialet för immunlokalisering av arabinogalaktanproteiner och pectiner är fixerat, inbäddat i ett hydrofilt akrylharts, sektionerat och monterat på glasrutschbanor. Vi visar cellvägg relaterade epitopes kommer att upptäckas med specifika antikroppar.

Abstract

Växtutveckling innebär ständiga justeringar av cellväggens sammansättning och struktur som svar på både inre och yttre stimuli. Cellväggarna består av cellulosa och icke-cellulosapolysackarider tillsammans med proteiner, fenolföreningar och vatten. 90% av cellväggen består av polysackarider (t.ex. pectins) och arabinogalactanproteiner (AGPs). Fluorescerande immunolokalisering av specifika glykan epitoper i växt histologiska sektioner är fortfarande ett viktigt verktyg för att avslöja ombyggnad av vägg polysackarid nätverk, struktur och komponenter.

Här rapporterar vi en optimerad fluorescerande immunolocalization förfarande för att upptäcka glycan epitopes från AGPs och pectins i växtvävnader. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fixering användes tillsammans med LR-Vit inbäddning av växtproverna, vilket möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och kompositionen. Tunna delar av de inbäddade prover som erhållits med en ultra-microtome användes för immunolocalization med specifika antikroppar. Denna teknik erbjuder bra upplösning, hög specificitet och chansen att upptäcka flera glykanepotoper i samma prov. Denna teknik möjliggör subcellulär lokalisering av glykaner och detekterar deras ackumuleringsnivå i cellväggen. Det tillåter också bestämning av spatio-temporala mönster av AGP och pektin distribution under utvecklingsprocesser. Användningen av detta verktyg kan i slutändan vägleda forskningsriktningar och länka glykaner till specifika funktioner i växter. Dessutom kan den erhållna informationen komplettera biokemiska studier och genuttrycksstudier.

Introduction

Växtcellväggar är komplexa strukturer bestående av polysackarider och glykoproteiner. Cellväggar är extremt dynamiska strukturer vars arkitektur, organisation och sammansättning varierar beroende på celltyp, lokalisering, utvecklingsstadium, yttre och inre stimuli¹. Arabinogalactan proteiner (AGPs) och pectins är viktiga komponenter i växtcellväggen. AGPs är mycket glykosylerade proteiner och pectins är homogalacturonan polysackarider vars sammansättning, mängd och struktur varierar kraftigt under olika växtutvecklingsstadier^2,3,4. AGPs och pektin studier har visat deras engagemang i flera växtprocesser såsom programmerad celldöd, svar på abiotiska påfrestningar, sexuell växtreproduktion, bland många andra⁵. De flesta av dessa studier började med information från immunolokaliseringsstudier.

Med tanke på dess komplexitet kräver studien av cellväggar många olika verktyg. Detektion av glykanepotoper med monoklonala antikroppar (mAbs) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att lösa polysackarid och glykoproteinfördelning längs denna struktur. Det finns en stor samling mAbs tillgängliga för att upptäcka glykan epitoper och specificiteten för varje mAb förbättras kontinuerligt samt⁶. Tekniken här beskrivs är tillämplig på alla växtarter och är ett perfekt verktyg för att vägleda framtida forskningsriktningar som kan innebära dyrare och mer komplexa tekniker.

I denna teknik är specifika antikroppar kemiskt konjugerade till fluorescerande färgämnen som FITC (fluorescein isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(och 6)-isothiocyanate) eller flera Alexa Fluor färgämnen. Immunofluorescens erbjuder flera fördelar, vilket möjliggör en tydlig och snabb subcellulär lokalisering av glykaner som kan observeras direkt under ett fluorescensmikroskop. Det är mycket specifikt och känsligt, eftersom beredningen av provet effektivt kan skydda antigenens naturliga struktur, även om det förekommer i lägre mängder. Det gör det möjligt att upptäcka flera antigener i samma prov och viktigast av allt, erbjuder högkvalitativa och visuellt vackra resultat. Trots den stora kraften som erbjuds av fluorescens immunolocalization studier, betraktas de ofta som svåra att utföra och genomföra troligen på grund av bristen på detaljerade protokoll som tillåter visualisering av de olika stegen i förfarandet. Här ger vi några enkla riktlinjer för hur man utför denna teknik och hur man får högkvalitativa bilder.

För protokollet som presenteras här måste proverna först åtgärdas och bäddas in med det lämpligaste fixeringen. Även om betraktas som en tidskrävande och relativt tråkig teknik, korrekt fixering och inbäddning av växtprovet är nyckeln till att säkerställa en framgångsrik immunolocalization analys. För detta ändamål är den vanligaste kemisk fixering med hjälp av korslänkande fixativ, som aldehyder. Korslänkande fixativ upprättar kemiska bindningar mellan vävnadens molekyler, stabiliserar och härdar provet. Formaldehyd och glutaraldehyd är korslänkande fixativ, och ibland används en blandning av båda^{fixativen 7}. Formaldehyd erbjuder stor strukturell bevarande av vävnader och under längre tidsperioder, producerar små vävnadsupprullningar och är kompatibel med immunostaining. Glutaraldehyd är ett starkare och stabilt fixativ som vanligtvis används i kombination med formaldehyd. Användningen av glutaraldehyd har vissa nackdelar som måste beaktas eftersom det introducerar vissa fria aldehydgrupper i den fasta vävnaden, vilket kan generera viss ospecificerad märkning. Även korskopplingen mellan proteiner och andra molekyler kan ibland göra vissa målepotoper otillgängliga för antikropparna. För att undvika detta måste fixeringens kvantitet och varaktighet noggrant definieras.

Efter fixering är proverna inbäddade i rätt harts för att härda innan sektionerna erhålls. London Harts (LR-White) akrylharts är det harts som val för immunolokaliseringsstudier. Till skillnad från andra hartser är LR-White hydrofil, vilket gör att antikropparna kan nå sina antigener, utan att behöva någon behandling för att underlätta det. LR-White har också fördelen att erbjuda låg auto-fluorescens, vilket möjliggör en minskning av bakgrundsljud under immunofluorescensavbildning.

Det finns många färgningstekniker tillgängliga för att upptäcka olika komponenter i cellväggen, såsom alciansk blå färgning, toluidinblå färgning eller periodisk syra-Schiff (PAS) färgning. Ingen av dessa erbjuder kraften i immunolocalization analyser⁸. Detta tillvägagångssätt ger större specificitet vid detektion av glykaner och erbjuder större information om cellväggens sammansättning och struktur.

Protocol

1. Provberedning: fixering, uttorkning och LR-vit inbäddning Fixering och uttorkningFIXERINGSPROCESSEN är avgörande för att bevara provet. genom att korsa samman molekyler stoppas cellulär metabolism, vilket säkerställer cellulär integritet och förhindrar molekylär diffusion. Fixeringsmedel och den koncentration som används måste anpassas till detta ändamål, så att antigenerna är tillräckligt exponerade för att interagera med antikropparna. Följande protokoll kombinerar d…

Representative Results

I ett framgångsrikt experiment kommer den sekundära antikroppen specifikt att fastställa platsen för den specifika epitopen i ljusgrönt, på ett konsekvent sätt, vilket möjliggör karakterisering av cellväggens sammansättning på ett visst utvecklingsstadium av cellen, vävnaden eller organet. Till exempel har LM6-antikroppen en hög affinitet för 1,5-arabinan, en förening med typ-I rhamnogalacturonan som finns rikligt med en märkning av cellväggen i den utvecklande Quercus-underkäke längre (<stro…

Discussion

Den fluorescerande immunolocalization metoden i växter här beskrivs, medan sömlöst okomplicerad, förlitar sig på framgången för flera små steg. Den första är provberedning och fixering. Under detta första steg används en blandning av formaldehyd och glutaraldehyd för att korsa huvuddelen av cellkomponenterna. Formaldehyden i lösningen ger en mild och reversibel fixering medan glutaraldehyden ger en stark mer permanent länkning; Balansen mellan de två fixativen ger lämplig mängd korslänkning, vilket g?…

Materials

25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)