Применение атомной микроскопии силы для обнаружения раннего остеоартрита
Summary
Мы представляем метод исследования ранних остеоартритных изменений на клеточном уровне в суставном хряще с помощью атомной микроскопии силы (AFM).
Abstract
Биомеханические свойства клеток и тканей не только регулируют их форму и функцию, но и имеют решающее значение для поддержания их жизнеспособности. Изменения в эластичности могут распространяться или вызывать начало основных заболеваний, таких как рак или остеоартрит (ОА). Микроскопия атомной силы (AFM) стала сильным инструментом для качественной и количественной характеристики биомеханических свойств конкретных биологических целевых структур в микроскопическом масштабе, измеряя силы в диапазоне от такой небольшой, как пиконьютон до микроньютона. Биомеханические свойства имеют особое значение в мышечных тканях, которые подвергаются высокому уровню деформации. ОА как дегенеративное заболевание хряща приводит к нарушению периклеточной матрицы (PcM) и пространственной перестановке хондроцитов, встроенных в их внеклеточной матрицы (ECM). Нарушение ПХМ и ECM было связано с изменениями в биомеханических свойствах хряща. В настоящем исследовании мы использовали AFM для количественной оценки этих изменений в связи с конкретными изменениями пространственного шаблона хондроцитов. С каждым изменением шаблона наблюдались значительные изменения в эластичности как для PCM, так и для ECM. Измерение локальной эластичности позволяет делать прямые выводы о степени локальной дегенерации тканей в ОА.
Introduction
Суставной хрящ является аваскулярной, аневральной ткани. Разреженные хондроциты производят, организуют и поддерживают экспансивную внеклеточную матрицу (ECM), в которую они встроены. Как отдельная и специализированная часть ECM, хондроциты окружены тонким слоем специализированной матрицы, известной как периклеточная матрица (PCM). PCM действует как mechanosensitive ячейки-матрицы интерфейс1, который защищает хондроциты2 и модулирует их биосинтетической реакции3. Как уже описано ранее4, в здоровом хряще, хондроциты расположены в конкретных, различных пространственных моделей, которые являются специфическими для каждого слоя ткани и сустава4,5 и зависит от совместного конкретных механических механизмов загрузки6. Эти модели меняются от пар и струн в здоровом хряще в двойные струны с началом остеоартрита (ОА). С дальнейшим прогрессированием заболевания хондроциты образуют небольшие кластеры, постепенно увеличиваясь в размерах до больших скоплений в передовых ОА. Полная потеря любой организационной структуры и индукция апоптоза наблюдается в конце этапа ОА. Таким образом, хондроцитов клеточного расположения может быть использован в качестве изображения на основе биомаркера для ОА прогрессии4.
Биомеханические свойства клеток и тканей не только регулируют их форму и функцию, но и имеют решающее значение для поддержания их жизнеспособности. Изменения в эластичности могут распространяться или вызывать начало основных заболеваний, таких как рак или ОА. Атомная силовая микроскопия (AFM) стала мощным инструментом для качественной и количественной характеристики биомеханических свойств конкретных биологических целевых структур в микроскопическом масштабе, измеряя широкий спектр силы, от пиконевтона до микроньютона. Основное применение AFM заключается в измерении рельефа поверхности и механических свойств образцов при субнанометровом разрешении7. Измерительное устройство состоит из трех основных компонентов: 1) зондAFM, который представляет собой острый наконечник, установленный на кантилевере и используется для прямого взаимодействия с поверхностью образца. Когда сила применяется к кантилевер, деформация последнего происходит в соответствии со свойствами измеренной ткани. 2) Оптическая система, которая проецирует лазерный луч на кантилевер, который затем отражается на детекторе. 3) Фотодиод детектор, который ловит свет отклоняется от кантилевера. Он преобразует полученную информацию о лазерном отклонении кантилевером в кривую силы, которая может быть проанализирована.
Таким образом, основным принципом AFM является обнаружение силы, действующей между зондом AFM и целевой структурой образца. Полученные кривые силы описывают механические свойства целевых структур на поверхности образца, такие как эластичность, распределение заряда, намагничиваемость, стресс урожайности и эластичная пластиковая динамика деформации8. Важным преимуществом AFM по сравнению с другими методами визуализации является то, что AFM может быть использован для измерения механических свойств живых клеток в средних или тканях в родном состоянии, не повреждая ткани. AFM может работать как в жидкостных, так и в сухих условиях. Не требуется для подготовки образца. AFM предоставляет возможность изображения образца и измерения его механических свойств одновременно в образцах, которые находятся вблизи физиологических условий. В настоящем исследовании мы описываем новый подход к оценке прогрессии ОА путем измерения эластичности PCM и ECM в родном суставном хряще. Корреляция пространственной организации хондроцитов со степенью локальной дегенерации тканей дает совершенно новую перспективу для раннего выявления ОА. Однако функциональная значимость этих моделей до сих пор не оценена. Поскольку основной функцией суставного хряща является нагрузка подшипника при низком трении, ткань должна обладать эластичными свойствами. AFM позволяет измерять не только эластичность ECM, но и пространственных клеточных моделей, встроенных в их PCM. Наблюдаемая корреляция эластичности с пространственным изменением узора хондроцитов настолько сильна, что измерение эластичности само по себе может позволить расслоение местной дегенерации тканей.
Упругие модули PCM и ECM оценивались в 35 мкм-тонких секциях с использованием системы AFM, интегрированной в перевернутый фазовый контрастный микроскоп, позволивший одновременно визуализировать образец хряща. Этот протокол основан на исследовании, уже опубликованном в нашей лаборатории9 и конкретно описывает, как охарактеризовать пространственное расположение хондроцитов и как измерить эластичность связанных с ними ПХМ и ECM. С каждым изменением шаблона хондроцитов, значительные изменения в эластичности можно также наблюдать как для PCM и ECM, что позволяет использовать этот метод для непосредственного измерения стадии дегенерации хряща.
Этот проверенный подход открывает новый способ оценки прогрессирования ОА и терапевтических эффектов на ранних стадиях до того, как макроскопическая деградация тканей начнет появляться. Выполнение измерений AFM последовательно является трудным процессом. В следующем протоколе мы описываем, как подготовить образец для измерения AFM, как выполнить фактические измерения AFM, начиная с подготовки кантилевера, как откалибровать AFM, а затем как выполнять измерения. Пошаговые инструкции дают четкий и лаконичный подход к получению надежных данных и обеспечивают основные стратегии их обработки и интерпретации. В разделе обсуждения также описаны наиболее распространенные подводные камни этого строгого метода и предоставляются полезные советы по устранению неполадок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя AFM в качестве новой и мощной техники для измерения биомеханических свойств биологических материалов на наноуровневом уровне, мы измерили эластичные свойства ECM и PCM в остеоартритном суставном хряще. Образцы хряща были отобраны в соответствии с их преобладающей пространствен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим наших соавторов из оригинальной публикации за их помощь и поддержку.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
