Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce
Summary
Presentiamo un metodo per studiare i primi cambiamenti osteoartritici a livello cellulare nella cartilagine articolare utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM).
Abstract
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell’elasticità possono propagare o innescare l’insorgenza di gravi malattie come il cancro o l’osteoartrite (OA). La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un forte strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di target biologiche su scala microscopica, misurando le forze in un intervallo da piccolo come il piconewton al micronewton. Le proprietà biomeccaniche sono di particolare importanza nei tessuti muscolo-scheletrici, che sono soggetti ad alti livelli di ceppo. L’OA come malattia degenerativa della cartilagine provoca l’interruzione della matrice pericellulare (PCM) e la riorganizzazione spaziale dei condrociti incorporati nella loro matrice extracellulare (ECM). L’interruzione nel PCM e nell’ECM è stata associata a cambiamenti nelle proprietà biomeccaniche della cartilagine. Nel presente studio abbiamo usato l’AFM per quantificare questi cambiamenti in relazione ai cambiamenti specifici del modello spaziale dei condrociti. Con ogni cambiamento di modello, sono stati osservati cambiamenti significativi nell’elasticità sia per il PCM che per l’ECM. Misurare l’elasticità locale permette quindi di trarre conclusioni dirette sul grado di degenerazione del tessuto locale in OA.
Introduction
La cartilagine articolare è un tessuto avascolare e aneurale. Condrociti scarsamente sparsi producono, organizzano e mantengono una matrice extracellulare espansiva (ECM) in cui sono incorporati. Come parte distinta e specializzata dell’ECM, i condrociti sono circondati da un sottile strato di matrice specializzata noto come matrice pericellulare (PCM). Il PCM agisce come un’interfaccia a matrice cellulare meccanosensitive1 che protegge i condrociti2 e modula la loro risposta biosintetica3. Come descritto in precedenza4, nella cartilagine sana, i condrociti sono disposti in modelli spaziali specifici e distinti specifici per ogni strato di tessuto e giunto4,5 e dipendono da meccanismi di caricamento meccanico specifici per le articolazioni6. Questi modelli cambiano da coppie e stringhe in cartilagine sana a stringhe doppie con l’inizio dell’osteoartrite (OA). Con l’ulteriore progressione della malattia i condrociti formano piccoli cluster, aumentando gradualmente a grandi cluster nell’OA avanzato. Una perdita completa di qualsiasi struttura organizzativa e induzione di apoptosi è osservata nella fase finale OA. Pertanto, la disposizione cellulare del condrocito può essere utilizzata come biomarcatore basato sull’immagine per la progressione OA4.
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell’elasticità possono propagarsi o innescare l’insorgenza di gravi malattie come il cancro o l’OA. La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un potente strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di bersaglio biologico su scala microscopica, misurando un’ampia gamma di forza, dal piconewton al micronewton. L’applicazione principale di AFM è quella di misurare la topografia superficiale e le proprietà meccaniche dei campioni alla risoluzione subnanometrica7. Il dispositivo di misura è costituito da tre componenti principali: 1) Una sonda AFM, che è una punta affilata montata su un sbalzo e viene utilizzata per l’interazione diretta con la superficie del campione. Quando la forza viene applicata al cantilever, la deformazione di quest’ultimo avviene in base alle proprietà del tessuto misurato. 2) Un sistema ottico che proietta un raggio laser sul cantilever, che viene poi riflesso in un’unità di rilevamento. 3) Un rilevatore di fotodiodo che cattura la luce deviata dallo sbalzo. Converte le informazioni ricevute per quanto riguarda la deflessione laser dal cantilever in una curva di forza che può essere analizzata.
Pertanto, il principio principale dell’AFM è il rilevamento della forza che agisce tra la sonda AFM e la struttura bersaglio del campione. Le curve di forza ottenute descrivono le proprietà meccaniche delle strutture bersaglio sulla superficie del campione come elasticità, distribuzione della carica, magnetizzazione, sollecitazione della resa e dinamica di deformazione plastica elastica8. Un importante vantaggio dell’AFM rispetto ad altre tecniche di imaging è che l’AFM può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche delle cellule vive in media o tessuti in uno stato nativo senza danneggiare il tessuto. AFM può operare sia in condizioni liquide che a secco. Non vi è alcun requisito per la preparazione del campione. AFM offre la possibilità di immaginare un campione e misurarne simultaneamente le proprietà meccaniche in campioni che sono condizioni quasi fisiologiche. Nel presente studio descriviamo un nuovo approccio per valutare la progressione dell’OA misurando l’elasticità del PCM e dell’ECM nella cartilagine articolare nativa. La correlazione dell’organizzazione spaziale dei condrociti con il grado di degenerazione locale dei tessuti fornisce una prospettiva completamente nuova per la diagnosi precoce dell’OA. La rilevanza funzionale di questi modelli non è stata tuttavia valutata finora. Poiché la funzione principale della cartilagine articolare è il carico che porta a basso attrito, il tessuto deve possedere proprietà elastiche. AFM permette di misurare non solo l’elasticità dell’ECM, ma anche dei modelli cellulari spaziali incorporati nel loro PCM. La correlazione osservata dell’elasticità con il cambiamento del modello spaziale dei condrociti è così forte che misurare l’elasticità da sola può consentire la stratificazione della degenerazione del tessuto locale.
La modulina elastica del PCM e dell’ECM è stata valutata in sezioni sottili sfere di 35 m utilizzando un sistema AFM integrato in un microscopio a contrasto di fase invertito che permetteva la visualizzazione simultanea del campione cartilagineo. Questo protocollo si basa su uno studio già pubblicato dal nostro laboratorio9 e descrive specificamente come caratterizzare la disposizione spaziale dei condrociti e come misurare l’elasticità dei loro PCM ed ECM associati. Con ogni cambiamento di modello dei condrociti, si possono osservare cambiamenti significativi nell’elasticità sia per il PCM che per l’ECM, consentendo di utilizzare questa tecnica per misurare direttamente lo stadio di degenerazione della cartilagine.
Questo approccio convalidato apre un nuovo modo per valutare la progressione dell’OA e gli effetti terapeutici nelle prime fasi prima che la degradazione del tessuto macroscopico inizi effettivamente ad apparire. L’esecuzione coerente delle misurazioni AFM è un processo arduo. Nel seguente protocollo viene descritto come preparare il campione da misurare con AFM, come eseguire le misurazioni AFM effettive a partire dalla preparazione del cantilever, come calibrare l’AFM e quindi come eseguire le misurazioni. Le istruzioni passo-passo forniscono un approccio chiaro e conciso per ottenere dati affidabili e fornire strategie di base per elaborarli e interpretarli. La sezione di discussione descrive anche le insidie più comuni di questo metodo rigoroso e fornisce utili suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando L’AFM come nuova e potente tecnica per misurare le proprietà biomeccaniche dei materiali biologici a livello su nanoscala, abbiamo misurato le proprietà elastiche dell’ECM e del PCM nella cartilagine articolare osteoartritica umana. I campioni della cartilagine sono stati selezionati in base al loro modello spaziale predominante dell’organizzazione dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione dei tessuti locali. Come previsto, è stato osservato un forte calo dei valori di elasti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i nostri co-autori della pubblicazione originale per il loro aiuto e supporto.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
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