Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce
Summary
Nous présentons une méthode pour étudier les changements ostéoarthritiques tôt au niveau cellulaire dans le cartilage articulaire en utilisant la microscopie de force atomique (AFM).
Abstract
Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’arthrose (arthrose). La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil solide pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant les forces dans une gamme allant du piconewton au microton. Les propriétés biomécaniques sont d’une importance particulière dans les tissus musculo-squelettiques, qui sont soumis à des niveaux élevés de tension. L’œil de maladie dégénérative du cartilage entraîne la perturbation de la matrice périellulaire (PCM) et le réarrangement spatial des chondrocytes intégrés dans leur matrice extracellulaire (ECM). La perturbation du PCM et de l’ECM a été associée à des changements dans les propriétés biomécaniques du cartilage. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’AFM pour quantifier ces changements par rapport aux changements spécifiques de modèle spatial des chondrocytes. À chaque changement de modèle, des changements significatifs dans l’élasticité ont été observés pour le PCM et l’ECM. La mesure de l’élasticité locale permet ainsi de tirer des conclusions directes sur le degré de dégénérescence locale des tissus dans l’œuvre d’oE.
Introduction
Le cartilage articulaire est un tissu aneural vasculaire. Les chondrocytes peu dispersés produisent, organisent et maintiennent une vaste matrice extracellulaire (ECM) dans laquelle elles sont intégrées. En tant que partie distincte et spécialisée de l’ECM, les chondrocytes sont entourés d’une fine couche de matrice spécialisée connue sous le nom de matrice périellulaire (PCM). Le PCM agit comme une interface mécanosensitive de matrice cellulaire1 qui protège les chondrocytes2 et module leur réponse biosynthétique3. Comme décrit précédemment4, dans le cartilage sain, les chondrocytes sont disposés dans des modèles spatiaux spécifiques et distincts qui sont spécifiques pour chaque couche de tissu et l’articulation4,5 et dépendent des mécanismes de chargement mécaniques spécifiques aux articulations6. Ces modèles changent des paires et des cordes dans le cartilage sain aux cordes doubles avec le début de l’arthrose (OA). Avec une progression plus poussée de la maladie, les chondrocytes forment de petits amas, augmentant graduellement en taille à de grands groupes dans l’œil avancé. Une perte complète de n’importe quelle structure organisationnelle et l’induction de l’apoptosis est observée dans l’OA de phase finale. Ainsi, l’arrangement cellulaire de chondrocyte peut être employé comme biomarqueur basé sur l’image pour la progressiond’OA 4.
Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’œd de l’œux. La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil puissant pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant un large éventail de forces, du piconewton au micronewton. L’application principale de l’AFM est de mesurer la topographie de surface et les propriétés mécaniques des échantillons à la résolution du sous-nanomètre7. Le dispositif de mesure se compose de trois composants principaux : 1) Une sonde AFM, qui est une pointe pointue montée sur un porte-à-faux et est utilisée pour l’interaction directe avec la surface de l’échantillon. Lorsque la force est appliquée au porte-à-faux, la déformation de ce dernier se produit selon les propriétés du tissu mesuré. 2) Un système optique qui projette un faisceau laser sur le porte-à-faux, qui est ensuite réfléchi à une unité de détecteur. 3) Un détecteur de photodiode qui attrape la lumière déviée du porte-à-faux. Il convertit les informations reçues concernant la déviation laser par le porte-à-faux en une courbe de force qui peut être analysée.
Ainsi, le principe principal de l’AFM est la détection de la force agissant entre la sonde AFM et la structure cible de l’échantillon. Les courbes de force obtenues décrivent les propriétés mécaniques des structures cibles sur la surface de l’échantillon comme l’élasticité, la distribution de charge, la magnétisation, le stress de rendement et la dynamique élastique de déformation plastique8. Un avantage important de l’AFM par rapport à d’autres techniques d’imagerie est que l’AFM peut être utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes dans les tissus moyens ou dans un état indigène sans endommager le tissu. L’AFM peut fonctionner à la fois dans des conditions liquides ou sèches. Il n’est pas nécessaire de préparer l’échantillon. L’AFM offre la possibilité d’imager un spécimen et de mesurer ses propriétés mécaniques simultanément chez des spécimens proches de conditions physiologiques. Dans la présente étude, nous décrivons une nouvelle approche pour évaluer la progression de l’œuvre d’oE en mesurant l’élasticité du PCM et de l’ECM dans le cartilage articulaire indigène. La corrélation de l’organisation spatiale des chondrocytes avec le degré de dégénérescence locale des tissus fournit une perspective complètement nouvelle pour la détection précoce de l’œux. La pertinence fonctionnelle de ces modèles n’a toutefois pas été évaluée jusqu’à présent. Parce que la fonction principale du cartilage articulaire est la charge portante à faible friction, le tissu doit posséder des propriétés élastiques. L’AFM permet de mesurer non seulement l’élasticité de l’ECM, mais aussi les modèles cellulaires spatiaux intégrés dans leur PCM. La corrélation observée de l’élasticité avec le changement de modèle spatial des chondrocytes est si forte que la mesure de l’élasticité seule peut permettre la stratification de la dégénérescence locale des tissus.
Des moduli élastiques du PCM et de l’ECM ont été évalués en sections minces de 35 m à l’aide d’un système AFM intégré dans un microscope de contraste de phase inversé qui a permis une visualisation simultanée de l’échantillon de cartilage. Ce protocole est basé sur une étude déjà publiée à partir de notre laboratoire9 et décrit spécifiquement comment caractériser l’arrangement spatial des chondrocytes et comment mesurer l’élasticité de leur PCM et ECM associés. Avec chaque changement de modèle des chondrocytes, des changements significatifs dans l’élasticité peuvent également être observés pour le PCM et l’ECM, permettant à cette technique d’être utilisée pour mesurer directement le stade de dégénérescence du cartilage.
Cette approche validée ouvre une nouvelle façon d’évaluer la progression de l’arthrose et les effets thérapeutiques à un stade précoce avant que la dégradation macroscopique des tissus commence réellement à apparaître. L’exécution cohérente des mesures de l’AFM est un processus ardu. Dans le protocole suivant, nous décrivons comment préparer l’échantillon à mesurer par l’AFM, comment effectuer les mesures réelles de l’AFM en commençant par la préparation du porte-à-faux, comment calibrer l’AFM, puis comment effectuer les mesures. Les instructions étape par étape donnent une approche claire et concise pour obtenir des données fiables et fournir des stratégies de base pour le traitement et l’interprétation. La section de discussion décrit également les pièges les plus courants de cette méthode rigoureuse et fournit des conseils utiles de dépannage.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant l’AFM comme une technique nouvelle et puissante pour mesurer les propriétés biomécaniques des matériaux biologiques à un niveau à l’échelle nanométrique, nous avons mesuré les propriétés élastiques de l’ECM et du PCM dans le cartilage articulaire ostéoarthritique humain. Des échantillons de cartilage ont été sélectionnés en fonction de leur modèle spatial prédominant de l’organisation de chondrocyte comme biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence locale de tissu. C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions nos co-auteurs de la publication originale pour leur aide et leur soutien.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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