Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

Summary

Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l’alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.

Abstract

La spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è un metodo potente per la caratterizzazione biofisica dei cambiamenti conformazionali enzimatici e delle interazioni enzima-substrato. Tra i suoi numerosi benefici, HDX-MS consuma solo piccole quantità di materiale, può essere eseguito in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura enzima/substrato, e può fornire informazioni risolte spazialmente sulla dinamica enzimatica conformazionale, anche per grandi enzimi e complessi multiproteina. Il metodo è iniziato dalla diluizione dell’enzima di interesse in tampone preparato in D₂O. Ciò innesca lo scambio di prozio in ammidi di legame peptidico (N-H) con deuterio (N-D). Nei punti di tempo di scambio desiderati, le aliquote di reazione vengono spente, l’enzima viene proteoliizzato in peptidi, i peptidi sono separati dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC), e il cambiamento di massa di ogni peptide (a causa dello scambio di idrogeno con deuterio) è registrato da MS. La quantità di assorbimento del deuterio da parte di ogni peptide dipende fortemente dall’ambiente locale di legame idrogeno di quel peptide. I peptidi presenti in regioni molto dinamiche del deuterio di scambio enzimatico molto rapidamente, mentre i peptidi derivati da regioni ben ordinate subiscono uno scambio molto più lento. In questo modo, il tasso HDX riporta la dinamica conformazionale enzimatica locale. Le perturbazioni ai livelli di assorbimento del deuterio in presenza di diversi ligandi possono quindi essere utilizzate per mappare i siti di legame dei ligandi, identificare le reti allosteriche e comprendere il ruolo della dinamica conformazionale nella funzione enzimatica. Qui, illustriamo come abbiamo usato HDX-MS per comprendere meglio la biosintesi di un tipo di prodotti naturali peptidici chiamati lanthipeptides. I lanthipeptidi sono peptidi geneticamente codificati che vengono modificati post-traslazionemente da grandi enzimi multifunzionali, conformazionali dinamici che sono difficili da studiare con i tradizionali approcci di biologia strutturale. HDX-MS fornisce una piattaforma ideale e adattabile per studiare le proprietà meccaniche di questi tipi di enzimi.

Introduction

Le proteine sono molecole strutturalmente dinamiche che campionano diverse conformazioni su scale di tempo che vanno dalla vibrazione del legame su scala femtoseconda ai riarrangiamenti di interi domini proteici che possono verificarsi^{per molti secondi 1}. Queste fluttuazioni conformazionali sono spesso aspetti critici della funzione enzimatica/proteica. Ad esempio, i cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando sono spesso di fondamentale importanza per modulare la funzione enzimatica, sia organizzando i residui attivi del sito necessari per la catalisi, definendo siti di legame del substrato in meccanismi cinetici sequenziali, proteggendo gli intermedi reattivi dall’ambiente, sia modulando la funzione enzimatica attraverso reti allosteriche. Recenti studi hanno anche dimostrato che la dinamica conformazionale può essere conservata durante l’evoluzione e che le perturbazioni ai moti molecolari conservati possono essere correlate con i cambiamenti nella specificità del substrato e l’emergere di nuove funzioni^{enzimatici 2,3}.

Negli ultimi anni, la spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è rapidamente emersa come una potente tecnica per sondare come i paesaggi conformazionali proteici rispondono a perturbazioni come il legame del ligando o la mutagenesi^4,5,6,7. In un tipico esperimento HDX-MS (Figura 1), una proteina di interesse viene messa in tampone preparata in D₂O, che innesca la sostituzione di protoni scambiabili con solventi con deuteria. Il tasso di scambio della moietà ammide dei legami peptidici dipende fortemente dal pH, dalla sequenza amminoacidica locale e dall’ambiente strutturale locale dell’ammide⁸. Le ammidi impegnate nelle interazioni di legame idrogeno (come quelle presenti in α-eliche e β fogli) si scambiano più lentamente delle ammidi nelle regioni non strutturate della proteina che sono esposte al solvente sfuso. Pertanto, l’estensione dell’assorbimento del deuterio è un riflesso della struttura dell’enzima. Ci si aspetta che enzimi conformi alla dinamica, o che subiscono transizioni strutturali al legame del ligando, producano una risposta HDX misurabile.

La base meccanicistica per il lento tasso di cambio di un’ammide strutturata è illustrata nella figura 2^5,8,9. Per sottoporsi all’HDX, la regione strutturata deve prima campionare transitoriamente una conformazione dispiegata, in modo che le molecole di solvente che catalizzano lo scambio di HDX attraverso uno specifico meccanismo acido/base chimica abbiano accesso all’ammide scambiabile. In definitiva, le grandezze relative del tasso di cambio chimico (k_chem) e i tassi di piegatura e ripiegamento (k_aperto e k_vicino) determinano il tasso di HDX misurato^{nell’esperimento 5,8}. Da questo semplice modello cinetico, è chiaro che l’estensione dell’assorbimento del deuterio rifletterà la dinamica conformazionale sottostante (come definita da k_open e k_close). La maggior parte degli esperimenti HDX-MS viene eseguita in un flusso di lavoro dal basso verso l’alto in cui, a seguito della reazione di scambio, la proteina di interesse viene digerita in peptidi e l’assorbimento del deuterio da parte di ciascun peptide viene misurato come un aumento della^{massa 7}. In questo modo, HDX-MS consente di mappare le perturbazioni alla dinamica enzimatica conformazionale sulla scala spaziale locale dei peptidi, consentendo al ricercatore di valutare come la perturbazione alteri la dinamica in diverse regioni dell’enzima di interesse.

I vantaggi dell’approccio HDX-MS per chiarire la dinamica strutturale delle proteine sono numerosi. In primo luogo, il metodo può essere eseguito con piccole quantità di proteine native o su complessi proteici in sistemi con struttura quaternaria¹⁰. Non è nemmeno necessario che il preparato enzimatico utilizzato nel saggio sia altamente purificato^11,12, purché il flusso di lavoro HDX-MS dal basso verso l’alto fornisca un numero sufficiente di peptidi identificati con sicurezza che coprono la sequenza proteica di interesse. Inoltre, HDX-MS può fornire informazioni sulla dinamica conformazionale in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura proteica site-specific come sarebbe utilizzata negli studi di fluorescenza a singola^{molecola 13}e non esiste un limite di dimensione al complesso proteico o proteico che può essere studiato (il che rende impegnativi approcci come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare [NMR])^7,14. Infine, i metodi HDX-MS risolti nel tempo possono essere utilizzati per studiare proteine intrinsecamente disordinate, che sono difficili da studiare con la cristallografia a raggi X^15,16,17,18. La limitazione principale di HDX-MS è che i dati sono a bassa risoluzione strutturale. I dati HDX-MS sono utili per indicare dove la dinamica conformazionale sta cambiando e per rivelare cambiamenti conformazionali accoppiati, ma spesso non forniscono molte informazioni sul preciso meccanismo molecolare che guida il cambiamento osservato. Recenti progressi nella combinazione di metodi di dissociazione da cattura elettronica con dati proteina HDX-MS hanno mostrato promesse per la mappatura dei siti di scambio a singoli residui di amminoacidi¹⁹, ma gli studi biochimici e strutturali di follow-up sono ancora spesso necessari per fornire chiarezza ai modelli strutturali inoltrato dai dati HDX-MS.

Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato per lo sviluppo di un test HDX-MS²⁰. I protocolli di preparazione del campione presentati di seguito dovrebbero essere generalmente applicabili a qualsiasi proteina che mostri una buona solubilità in tamponi acquosi. Metodi di preparazione dei campioni più specializzati e flussi di lavoro HDX-MS sono disponibili per le proteine di quanto sia necessario saggiare in presenza di detergente o fosfolipidi^21,22,23,24. Le impostazioni strumentali per la raccolta dei dati HDX-MS sono descritte per uno spettrometro di massa quadrupolo ad alta risoluzione accoppiato al sistema di cromatografia liquida. Dati di complessità e risoluzione simili potrebbero essere raccolti su uno qualsiasi dei numerosi sistemi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) disponibili in commercio. Vengono inoltre forniti aspetti chiave del trattamento dei dati utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio. Presentiamo anche linee guida per la raccolta e l’analisi dei dati coerenti con le raccomandazioni formulate dalla più ampia comunità HDX-MS¹². Il protocollo descritto viene utilizzato per studiare le proprietà strutturali dinamiche di HalM2, una sintetasi lanthipeptide che catalizza la maturazione multistep di un prodotto naturale peptide antimicrobico²⁰. Illustriamo come HDX-MS può essere utilizzato per rivelare siti di legame del substrato e proprietà allosteriche che sono sfuggite alla caratterizzazione precedente. Diversi altri protocolli sulle proteine HDX-MS sono stati pubblicati negli ultimi anni^25,26. Insieme al presente lavoro, questi contributi precedenti dovrebbero fornire al lettore una certa flessibilità nella progettazione sperimentale.

Protocol

1. Preparazione di reagenti deuterati e soluzioni per stock enzimatici Preparare i reagenti necessari per le reazioni HDX (inclusi eventuali tamponi, sali, substrati, ligandi, ecc.) come soluzioni di stock concentrato 100−200x in D2O (frazione atomica 99,9% D). Preparare almeno 50 mL di soluzione di scorta stabilizzatrice.NOTA: Per la caratterizzazione di HalM2, sono state preparate le seguenti soluzioni: 500 mM MgCl2, 100 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP), 750 mM ATP (nel buffe…

Representative Results

È necessario valutare la qualità della digestione proteolitica e la riproducibilità del flusso di lavoro per ogni serie di iniezioni di campioni. Pertanto, prima di eseguire test HDX-MS, è essenziale stabilire condizioni efficaci per la proteolisi della proteina di interesse, per la separazione dei peptidi utilizzando la cromatografia liquida in fase inversa e la mobilità ionica in fase gassosa e per il rilevamento di peptidi che utilizzano la SM. A tal fine, i campioni di riferimento per la proteina di interesse (r…

Discussion

Il flusso di lavoro HDX-MS presentato in questo protocollo fornisce una piattaforma straordinariamente robusta per mappare la distribuzione spaziale di elementi strutturalmente dinamici nelle proteine e per indagare come queste dinamiche cambiano in risposta alla perturbazione (legame del ligando, mutagenesi enzimatica, ecc.). L’HDX-MS presenta diversi vantaggi distinti rispetto ad altri approcci di biologia strutturale che sono comunemente usati per studiare la dinamica conformazionale. In particolare, sono necessarie s…

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
acetonitrile	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
formic acid	Thermo Fisher	28905
guanidine-HCl	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
Magnesium chloride	SiGMA-Aldrich	63068-250G
Potassium chloride	BioBasic	PB0440
potassium phosphate	BioBasic	PB0445
TCEP Hydrochloride	TRC Canada	T012500	peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
software
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System	Waters
HDX Manager	Waters
microtip pH electrode	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters