اكتشاف جينات السائق في الخلايا القولونية HT29 المشتقة من السرطان الجذعية مثل الأورام
Summary
هنا هو بروتوكول لاكتشاف جينات السائق المفرطة في التعبير عن الحفاظ على الخلايا الجذعية السرطان المنشأة المستمدة من خلايا HT29 القولون والمستقيم. تم تنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للتحقيق وفحص شبكات التعبير الجيني لتوضيح آلية محتملة تشارك في بقاء الخلايا السرطانية المستهدفة.
Abstract
تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا حيويًا ضد العلاجات السريرية، مما يساهم في انتكاس الورم. هناك العديد من الأونكوجينات المشاركة في ورمريجنيسيس وبدء خصائص الجذعية السرطان. وبما أن التعبير الجيني في تكوين أورام الخلايا القولونية المشتقة من سرطان القولون والمستقيم غير واضح، فإن اكتشاف الآليات التي تعمل على جين واحد في كل مرة يستغرق وقتاً. توضح هذه الدراسة طريقة لاكتشاف جينات السائق المشاركة في بقاء الخلايا الجذعية الشبيهة بسرطان القولون والمستقيم في المختبر. تم اختيار الخلايا السرطانية HT29 القولون والمستقيم التي تعبر عن LGR5 عندما مثقف كما spheroids ومرافقة زيادة علامات الجذعية CD133 واستخدامها في هذه الدراسة. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرط في تشكيل HT29 مستقيم مشتقة من الأورام الجذعية مثل. ويمكن للمنهجية أن تفحص تكتشف بسرعة جينات السائق المحتمل في نماذج أمراض أخرى.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي للوفاة مع ارتفاع معدل انتشار ووفيات في جميع أنحاء العالم1,2. بسبب الطفرات الجينية والتضخيم، تنمو الخلايا السرطانية دون السيطرة التكاثرية، مما يساهم في بقاء الخلايا3، المضادة لتخثر الدم4، والسرطان stemness5،6،7. داخل نسيج الورم، يسمح عدم تجانس الورم للخلايا السرطانية بالتكيف والبقاء على قيد الحياة أثناء العلاجات العلاجية8. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs), مع معدل أعلى من التجديد الذاتي و تعدد القدرات من أنواع السرطان التفاضلية, هي المسؤولة بشكل رئيسي عن تكرار الورم9,,10 و CRC11النقيلي . CSCs الحاضر أكثر مقاومة للأدوية12,13,,14 و خصائص مضادة لتخثر الدم15,16, وبالتالي نجاة الأورام العلاج الكيميائي.
هنا، من أجل التحقيق في الآلية المحتملة ل stemness في الخلايا الجذعية CRC مختارة، تم تنفيذ RNAseq لفحص الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في spheroids الورم. الخلايا السرطانية يمكن أن تشكل spheroids (وتسمى أيضا أورامسفيرس) عندما تنمو في ظروف الالتزام المنخفضة وحفزت عوامل النمو المضافة إلى المتوسطة مثقف, بما في ذلك EGF, bFGF, HGF, وIL6. ولذلك، اخترنا CRC HT29 الخلايا السرطانية التي تقاوم العلاج الكيميائي مع زيادة في STAT3 الفوسفورية عندما تعامل مع oxaliplatin وirinotecon17. بالإضافة إلى ذلك، أعرب HT29 علامات الصلابة أعلى عندما مثقف في ظروف الثقافة الموصوفة. أعرب نموذج CSC المستمدة من HT29 كميات أعلى من تكرار الغنية بالليسين التي تحتوي على مستقبلات G-protein-coupled 5 (LGR5)18, علامة محددة من الخلايا الجذعية CRC19,20. وعلاوة على ذلك، CD133، تعتبر علامة حيوية عامة للخلايا الجذعية السرطانية، وأعرب أيضا عن ذلك بشدة في خط الخلية HT2921. الغرض من هذا البروتوكول هو اكتشاف مجموعات من جينات السائق في الأورام السرطانية المنشأة الشبيهة بـ stem استناداً إلى مجموعات البيانات المعلوماتية الحيوية بدلاً من التحقيق في أونكوجينيس الفردية22. وهو يحقق في الآليات الجزيئية المحتملة من خلال تحليل RNAseq متبوعاً بتحليلات المعلوماتية الحيوية المتاحة.
الجيل التالي هو عالية الإنتاجية ، متاحة بسهولة ، وموثوق بها الحمض النووي طريقة التسلسل على أساس المساعدة الحسابية ، وتستخدم لفرز شامل الجينات السائق لتوجيه علاجات الورم23. وتستخدم أيضا التكنولوجيا للكشف عن التعبير الجيني من النسخ العكسي لعينة معزولة RNA24. ومع ذلك، عند الفحص مع RNAseq، قد لا يكون للجينات الأكثر أهمية لاستهداف مع العلاج أعلى الفرق التعبير بين العينات التجريبية والسيطرة. لذلك ، تم تطوير بعض المعلوماتية الحيوية لتصنيف وتحديد الجينات على أساس مجموعات البيانات الحالية مثل KEGG25، GO26،27، أو PANTHER28، بما في ذلك تحليل مسار الإبداع (IPA)29 و NetworkAnalyst30. هذا البروتوكول يظهر التكامل بين RNAseq و NetworkAnalyst لاكتشاف مجموعة من الجينات بسرعة في spheroids HT29 المشتقة من HT29 مقارنة مع خلايا HT29 الأبوية. كما يقترح تطبيق هذه الطريقة على نماذج الأمراض الأخرى لاكتشاف الاختلافات في الجينات الهامة.
بالمقارنة مع التحقيق في التعبير الجيني الفردي ، فإن تقنية عالية الإنتاجية توفر مزايا للعثور على جينات السائق المحتملة بسهولة للطب الدقيق للورم. مع مجموعات البيانات المفيدة مثل KEGG أو GO أو PANTHER ، يمكن تحديد جينات محددة استنادًا إلى نماذج المرض ، أو مسارات الإشارة ، أو وظائف محددة ، وهذا يسمح بالتركيز بسرعة على جينات محددة ومهمة ، مما يوفر الوقت وتكاليف البحث. ويستخدم تطبيق مماثل في الدراسات السابقة14،18،31. على وجه الخصوص، الورم هو أكثر تعقيدا لأن أنواع مختلفة من الأورام تعبر عن الجينات التمييزية ومسارات البقاء على قيد الحياة والانتشار. لذلك، يمكن لهذا البروتوكول التقاط الجينات التي تميز أنواع الأورام المختلفة في ظل ظروف مختلفة. هناك إمكانية لإيجاد استراتيجيات فعالة لمكافحة السرطان من خلال فهم آلية التعبير الجيني المحدد.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، تم استخدام أورام مثل السرطان مثل السرطان المستزرع كنموذج في تحليل بيانات RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة. لنموذج المرض، تم استخدام أورام مشتقة من HT29. لأن الأورام لديها مقاومة للأدوية ضد علاجات الورم، يمكن استخدام النموذج المنشأة للتحقيق في الآليات التفصيلية للمقاومة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون المختبر الأساسي لمختبرات البيولوجيا الإشعاعية التابع لمعهد البحوث الإشعاعية، مستشفى تشانغ جونج التذكاري، على الدعم التقني. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح من مستشفى تشانغ جونج التذكاري (CMRPD1J0321), مستشفى تشنغ هسين العام (هرمون النمو 106-06), ومستشفى ماكاي التذكاري (MMH-CT-10605 وMMH-106-61). ولم يكن لهيئات التمويل أي تأثير في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
