Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal
Summary
Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.
Abstract
Las células madre cancerosas desempeñan un papel vital contra las terapias clínicas, contribuyendo a la recaída tumoral. Hay muchos oncogenes involucrados en la tumorigenesis y el inicio de las propiedades del tallo del cáncer. Dado que la expresión génica en la formación de tumores tirectales derivados del cáncer no está clara, se necesita tiempo para descubrir los mecanismos que trabajan en un gen a la vez. Este estudio demuestra un método para descubrir rápidamente los genes conductores implicados en la supervivencia de las células similares al cáncer colorrectal in vitro. En este estudio se seleccionaron y utilizaron células cancerosas HT29 colorrectales que expresan el LGR5 cuando se cultivan como esferoides y acompañan a un aumento de los marcadores de vástago CD133. El protocolo presentado se utiliza para realizar RNAseq con bioinformática disponible para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados en la formación de tumores tirásticos derivados del tallo colorrectal. La metodología puede detectar y descubrir rápidamente posibles genes conductores en otros modelos de enfermedades.
Introduction
El cáncer colorrectal (CRC) es una de las principales causas de muerte con alta prevalencia y mortalidad en todo el mundo1,,2. Debido a mutaciones genéticas y amplificaciones, las células cancerosas crecen sin control proliferativo, lo que contribuye a la supervivencia celular3,la antipoptosis4y la íltividad del cáncer5,,6,,7. Dentro de un tejido tumoral, la heterogeneidad tumoral permite que las células tumorales se adapten y sobrevivan durante los tratamientos terapéuticos8. Las células madre cancerosas (CSC), con una mayor tasa de auto-renovación y pluripotencia que los tipos diferenciales de cáncer, son principalmente responsables de la recurrencia tumoral9,,10 y la CRC metastásica11. Los CCC presentan más resistencia a los medicamentos12,13,14 y propiedades anti-apoptosis15,16, sobreviviendo así a las quimioterapias tumorales.
Aquí, con el fin de investigar el mecanismo potencial para el tallo en las células madre CRC seleccionadas, RNAseq se realizó para examinar los genes expresados diferencialmente en los esferoides tumorales. Las células cancerosas pueden formar esferoides (también llamados tumoresferas) cuando se cultivan en condiciones de baja adherencia y estimuladas por factores de crecimiento añadidos al medio cultivado, incluyendo EGF, bFGF, HGF, y IL6. Por lo tanto, seleccionamos células tumorales CRC HT29 que resisten las quimioterapias con un aumento de STAT3 fosforilado cuando se tratan con oxaliplatina e irinotecon17. Además, HT29 expresó marcadores de tallo más altos cuando se cultiva en las condiciones de cultivo descritas. El modelo CSC derivado de HT29 expresaba mayores cantidades de receptor acoplado por proteína G rico en leucina 5 (LGR5)18, un marcador específico de células madre CRC19,20. Además, CD133, considerado un biomarcador general para las células madre cancerosas, también está muy expresado en la línea celular HT2921. El propósito de este protocolo es descubrir grupos de genes conductores en las tumoresferas similares al cáncer establecidas basadas en conjuntos de datos bioinformáticos en lugar de investigar oncogenesindividuales 22. Investiga posibles mecanismos moleculares a través del análisis RNAseq seguido de análisis bioinformáticos disponibles.
La secuenciación de próxima generación es un método de secuenciación de ADN de alto rendimiento, fácil de disponible y fiable basado en la ayuda computacional, utilizado para examinar exhaustivamente los genes del conductor para guiar las terapias tumorales23. La tecnología también se utiliza para detectar la expresión génica a partir de la transcripción inversa de una muestra de ARN aislada24. Sin embargo, al realizar el cribado con RNAseq, los genes más importantes a atacar con terapia pueden no tener el diferencial de expresión más alto entre las muestras experimentales y de control. Por lo tanto, se desarrollaron algunas bioinformáticas para clasificar e identificar genes basados en conjuntos de datos actuales como KEGG25,GO26,,27o PANTHER28,incluyendo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 y NetworkAnalyst30. Este protocolo muestra la integración de RNAseq y NetworkAnalyst para descubrir rápidamente un grupo de genes en los esferoides derivados de HT29 seleccionados en comparación con las células HT29 parentales. También se sugiere la aplicación de este método a otros modelos de enfermedades para descubrir diferencias en genes importantes.
En comparación con la investigación de la expresión génica individual, una técnica de alto rendimiento proporciona ventajas para encontrar genes potenciales del conductor fácilmente para la medicina de precisión tumoral. Con conjuntos de datos útiles como KEGG, GO o PANTHER, se pueden identificar genes específicos basados en los modelos de la enfermedad, las vías de señalización o funciones específicas, y esto permite centrarse rápidamente en genes específicos e importantes, ahorrando tiempo y costos de investigación. Una aplicación similar se utiliza en estudios anteriores14,18,31. En particular, un tumor es más complicado porque diferentes tipos de tumores expresan genes y vías distintivas para la supervivencia y la proliferación. Por lo tanto, este protocolo puede detectar genes que distinguen diferentes tipos de tumores en diferentes circunstancias. Existe el potencial de encontrar estrategias eficaces contra el cáncer mediante la comprensión del mecanismo de expresión génica específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se utilizaron tumores de tipo tallo cultivado como modelo en el análisis de datos RNAseq con bioinformática disponible. Para un modelo de enfermedad, se utilizaron tumores timóferas derivadas de HT29. Debido a que las tumoresferas tienen resistencia a los medicamentos contra las terapias tumorales, el modelo establecido se puede utilizar para investigar los mecanismos detallados de resistencia mediante la investigación de las diferencias en la expresión génica. Además, la tecnología genómica que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el Laboratorio Básico de Biología radiológica del Instituto de Investigación Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, por su apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por subvenciones del hospital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), y Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 y MMH-106-61). Los organismos de financiación no tuvieron ninguna influencia en el diseño del estudio y la recopilación, análisis e interpretación de datos o en la escritura del manuscrito.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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