JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Published: July 22, 2020
doi:
10.3791/61077
, , ,
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research,Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences,Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology,Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine,Mackay Memorial Hospital

Summary

Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.

Abstract

Kanser kök hücreleri klinik tedavilere karşı hayati bir rol oynar, tümör nüks katkıda. Tümörigenez ve kanser sapı özelliklerinin başlatılması nda birçok onkogen vardır. Kolorektal kanser kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunda gen ekspresyonu belirsiz olduğundan, bir seferde bir gen üzerinde çalışan mekanizmaları keşfetmek zaman alır. Bu çalışma, kolorektal kanser kök benzeri hücrelerin in vitro hayatta kalma dahil sürücü genleri hızlı bir şekilde keşfetmek için bir yöntem göstermektedir. Kolorektal HT29 kanser hücreleri, küresel olarak kültürlendiğinde LGR5’i ifade eden ve bu çalışmada CD133 kök belirteçlerinin artmasına eşlik eden kanser hücreleri seçilmiş ve kullanılmıştır. Sunulan protokol, kolorektal HT29 kaynaklı kök benzeri tümör kürelerinin oluşumunda aşırı ifade edilen sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için mevcut biyoinformatik ile RNAseq’yi gerçekleştirmek için kullanılır. Metodoloji hızlı bir şekilde tarama ve diğer hastalık modellerinde potansiyel sürücü genleri keşfetmek.

Introduction

Kolorektal kanser (CRC) yüksek yaygınlık ve mortalite dünya çapında 1 ile önde gelen ölüm nedenidir1,2. Gen mutasyonları ve amplifikasyonlar nedeniyle, kanser hücreleri proliferatif kontrol olmadan büyümek, hangi hücre sağkalım katkıda3, anti-apoptosis4, ve kanser sapı5,6,7. Tümör dokusu içinde tümör heterojenitesi tümör hücrelerinin terapötik tedaviler sırasında uyum sağlamasını ve hayatta kalmalarını sağlar8. Kanser kök hücreleri (CSCs), diferansiyel kanser türlerine göre kendini yenileme ve pluripotency daha yüksek bir oranda, esas olarak tümör nüks sorumludur9,10 ve metastatik CRC11. CSCs daha fazla ilaç direnci mevcut12,13,14 ve anti-apoptoz özellikleri15,16, böylece tümör kemoterapi hayatta.

Burada, seçilen CRC kök hücrelerinde köklük için potansiyel mekanizmayı araştırmak amacıyla, Tümör sferoidlerinde farklı olarak ifade edilen genleri taramak için RNAseq uygulandı. Kanser hücreleri, düşük yapışma koşullarında büyüdüğünde ve EGF, bFGF, HGF ve IL6 gibi kültürlü ortama eklenen büyüme faktörleri tarafından uyarıldığında küresel (tümör küreleri olarak da adlandırılır) oluşturabilir. Bu nedenle oksaliplatin ve irinoteon17ile tedavi edildiğinde fosforilasyonLU STAT3 artışı ile kemoterapiye direnen CRC HT29 tümör hücrelerini seçtik. Buna ek olarak, HT29 açıklanan kültür koşullarında kültürlü zaman yüksek kök belirteçleri ifade etti. HT29 türetilmiş CSC modeli lösin açısından zengin tekrar içeren G-protein-çiftreseptör 5 (LGR5)18,CRC kök hücrelerinin belirli bir belirteç19,,20yüksek miktarlarda ifade . Ayrıca, CD133, kanser kök hücreleri için genel bir biyomarker olarak kabul, ayrıca yüksek HT29 hücre hattı21ifade edilir. Bu protokolün amacı, bireysel onkogenlerin araştırılması yerine biyoinformatik veri setlerine dayalı kanser sapı benzeri tümör kürelerinde sürücü genlerinin gruplarını keşfetmektir22. Mevcut biyoinformatik analizleri takip eden RNAseq analizi ile potansiyel moleküler mekanizmaları inceler.

Yeni nesil sıralama, tümör tedavileri23rehberlik için kapsamlı ekran sürücü genleri için kullanılan hesaplamalı yardıma dayalı, yüksek iş gücü, kolayca kullanılabilir ve güvenilir DNA sıralama yöntemidir. Bu teknoloji aynı zamanda gen ekspresyonunu izole edilmiş bir RNA örneğinin ters transkripsiyonundan tespit etmek için de kullanılır24. Ancak RNAseq ile tarama yapılırken, tedavi ile hedeflenene en önemli genler deneysel ve kontrol örnekleri arasında en yüksek ekspresyon farkı olmayabilir. Bu nedenle, bazı biyoinformatik sınıflandırmak ve KEGG25, GO26,27, veya PANTHER28gibi mevcut veri setleri dayalı genlerin sınıflandırılması ve tanımlanması için geliştirilmiştir , Marifet Pathway Analizi dahil (IPA)29 ve NetworkAnalyst30. Bu protokol, seçilen HT29 türetilmiş küresel hücrelerdeki bir grup geni ebeveyn HT29 hücrelerine kıyasla hızlı bir şekilde keşfetmek için RNAseq ve NetworkAnalyst’in entegrasyonunu göstermektedir. Bu yöntemin diğer hastalık modellerine uygulanması da önemli genlerdeki farklılıkların keşfedilmesi için önerilmektedir.

Bireysel gen ekspresyonunun araştırılmasıile karşılaştırıldığında, yüksek iş gücü tekniği tümör hassas tıbbı için potansiyel sürücü genlerini kolayca bulma nın avantajlarını sağlar. KEGG, GO veya PANTHER gibi yararlı veri kümeleri ile, belirli genler hastalık modelleri, sinyal yolları veya belirli fonksiyonlara göre tanımlanabilir ve bu hızlı bir şekilde belirli, önemli genlere odaklanmanızı, zaman ve araştırma maliyetlerinden tasarruf etmenizi sağlar. Benzer bir uygulama önceki çalışmalarda14,18,31kullanılır. Özellikle, tümörlerin farklı türleri hayatta kalma ve çoğalma için ayırt edici genler ve yollar ifade çünkü bir tümör daha karmaşıktır. Bu nedenle, bu protokol farklı koşullar altında farklı tümör tiplerini ayıran genleri toplayabilir. Spesifik gen ekspresyonunun mekanizmasını anlayarak kanserlere karşı etkili stratejiler bulma potansiyeli vardır.

Protocol

1. Hücre kültürü ve tümörlü küre oluşumu Kültür HT29 hücreleri 10 cm çanak Dulbecco modifiye kartal orta içeren (DMEM) ile 10% fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik (P / S). Hücreleri 37 °C’de % 5 CO2 ve nem oranıyla aseptik koşullarda biraraya gelene kadar büyütün. 37 °C’de 5 dakika boyunca %0,25 tripsin ile 1 mL’lik HT29 hücrelerini tripsini nötralize etmek ve dolayısıyla FBS ve %1 P/S ile 2 mL DMEM ekleyerek t…

Representative Results

Kanser kök hücrelerinde mekanizmayı araştırmak için modeli oluşturmak için, kolorektal HT29 hücreleri B27, EGF, bFGF, HGF ve IL6 içeren düşük ekli plaka içinde kanser kök benzeri tümörküreler in vitro kültür için kullanılmıştır. Tümör küreleri >100 μm çapında 7 gün içinde oluşmuştur (Şekil 1A). Tümör küreler tek hücrelere triptik edilmiştir ve LGR5 ve CD133 ekspresyonu saptanması için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. HT29 güdül…

Discussion

Bu çalışmada, mevcut biyoinformatik ile RNAseq verilerinin analizinde kültürkanser sapbenzeri tümörküreler model olarak kullanılmıştır. Bir hastalık modeli için HT29 türetilmiş tümör küreler kullanıldı. Tümör küreleri tümör tedavilerine karşı ilaç direncine sahip olduğundan, gen ekspresyonundaki farklılıkları araştırarak direnç lerinin ayrıntılı mekanizmalarını araştırmak için kurulan model kullanılabilir. Ayrıca, mevcut biyoinformatik ile RNAseq kullanarak genomik teknoloji …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Radyasyon Biyoloji çekirdek laboratuvarı Radyolojik Araştırma Enstitüsü, Chang Gung Memorial Hastanesi, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) ve Mackay Memorial Hastanesi (MMH-CT-10605 ve MMH-106-61) tarafından desteklenmiştir. Finansman kuruluşlarının çalışmanın ve verilerin toplanması, analiz ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında herhangi bir etkisi yoktu.

Materials

iRiS Digital Cell Imaging System Logos Biosystems, Inc I10999 for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry BD biosciences FACSCalibur for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE Biolegend 373803 LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE Biolegend 372803 CD133 detection reagent
EGF GenScript Z00333 for culture of tumorspheres
bFGF GenScript Z03116 for culture of tumorspheres
HGF GenScript Z03229 for culture of tumorspheres
IL6 GenScript Z03034 for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit Invitrogen 12183025 isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance Biotools, Taiwan RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada http://www.networkanalyst.ca/
Prism GraphPad Software a statistical analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).

Tags

Colorectal CancerTumorspheresDriver GenesRNA-SeqBioinformaticsCancer StemnessFlow CytometryRNA IsolationDifferential Gene Expression
check_url/61077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cheng, C., Hsu, P., Sie, Z., Chen, F. Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres. J. Vis. Exp. (161), e61077, doi:10.3791/61077 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image