Upptäckten av driver gener i kolorektal HT29-härledda Cancer Stem-liknande tumorspheres
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka överuttryckta föraren gener upprätthålla etablerade cancer stamceller som härrör från kolorektal HT29 celler. RNAseq med tillgängliga bioinformatik utfördes för att undersöka och screen gen uttryck nätverk för att belysa en potentiell mekanism som deltar i överlevnaden av riktade tumörceller.
Abstract
Cancer stamceller spelar en viktig roll mot kliniska terapier, bidrar till tumör återfall. Det finns många onkogener inblandade i tumorigenesis och inledandet av cancer stemness egenskaper. Eftersom genuttryck i bildandet av kolorektal cancer-härledda tumörersfärer är oklart, tar det tid att upptäcka de mekanismer som arbetar på en gen i taget. Denna studie visar en metod för att snabbt upptäcka föraren gener som deltar i överlevnaden av kolorektal cancer stamceller in vitro. Kolorektal HT29 cancerceller som uttrycker LGR5 när odlade som sfäroider och åtfölja en ökning CD133 stamhet markörer valdes ut och används i denna studie. Protokollet presenteras används för att utföra RNAseq med tillgängliga bioinformatics att snabbt avslöja överuttryckt föraren gener i bildandet av kolorektal HT29-härledda stam-liknande tumorspheres. Metoden kan snabbt screena och upptäcka potentiella förargener i andra sjukdomsmodeller.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är en ledande dödsorsak med hög prevalens och dödlighet i världen1,2. På grund av genmutationer och förstärkningar växer cancerceller utan proliferativ kontroll, vilket bidrar till cellöverlevnad3, anti-apoptos4och cancerstamness5,,6,7. Inom en tumörvävnad tillåter tumörens heterogenitet tumörceller att anpassa sig och överleva under terapeutiska behandlingar8. Cancer stamceller (CSCs), med en högre grad av självförnyelse och pluripotens än olika cancertyper, är huvudansvariga för tumör återkommande9,,10 och ögonbevarande CRC11. CSCs presentera mer resistens12,13,14 och anti-apoptos egenskaper15,16, vilket överlevande tumör kemoterapi.
Här, för att undersöka den potentiella mekanismen för stamhet i de valda CRC stamceller, RNAseq utfördes för att skärmen differentially uttryckta gener i tumör sfäroider. Cancercellerna kan bilda sfäroider (även kallade tumorspheres) när de odlas i låga följsamhet villkor och stimuleras av tillväxtfaktorer läggas till odlade medium, inklusive EGF, bFGF, HGF, och IL6. Därför valde vi CRC HT29 tumörceller som motstår kemoterapier med en ökning av fosforylerade STAT3 när de behandlades med oxaliplatin och irinotecon17. Dessutom uttryckte HT29 högre stamhet markörer när odlade i den beskrivna kulturförhållanden. Den HT29-härledda CSC-modellen uttryckte högre mängder leucinrika upprepa-innehållande G-protein-kopplad receptor 5 (LGR5)18, en specifik markör för CRC-stamceller19,20. Dessutom uttrycks CD133, som anses vara en allmän biomarkör för cancerceller, också starkt uttryckt i HT29-cellinje21. Detta protokoll syfte är att upptäcka grupper av förare gener i den etablerade cancer stem-liknande tumörersfärer baserade på bioinformatik dataset i motsats till att undersöka enskilda onkogener22. Den undersöker potentiella molekylära mekanismer genom RNAseq-analys följt av tillgängliga bioinformatikanalyser.
Nästa generations sekvensering är en hög genomströmning, lättillgänglig, och tillförlitlig DNA-sekvensering metod baserad på beräkningshjälp, som används för att omfattande screen driver gener för vägledande tumörterapier23. Tekniken används också för att upptäcka genuttryck från omvänd transkription av ett isolerat RNA-prov24. Men vid screening med RNAseq, de viktigaste generna att rikta med terapi kanske inte har den högsta uttrycksskillnaden mellan experimentella och kontroll prover. Därför har vissa bioinformatik utvecklats för att klassificera och identifiera gener baserade på aktuella datamängder som KEGG25,GO26,27eller PANTHER28, inklusive Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 och NetworkAnalyst30. Detta protokoll visar integrationen av RNAseq och NetworkAnalyst att snabbt upptäcka en grupp gener i de utvalda HT29-härledda sfäroider jämfört med föräldrarnas HT29 celler. Tillämpning av denna metod till andra sjukdomsmodeller föreslås också för att upptäcka skillnader i viktiga gener.
Jämfört med undersökning av individuella genuttryck ger en teknik med hög genomströmning fördelar med att enkelt hitta potentiella förargener för tumörprecisionsmedicin. Med användbara datamängder som KEGG, GO eller PANTHER kan specifika gener identifieras baserat på sjukdomsmodeller, signalvägar eller specifika funktioner, och detta möjliggör snabbt fokus på specifika, viktiga gener, vilket sparar tid och forskningskostnader. En liknande tillämpning används i tidigare studier14,18,31. Särskilt är en tumör mer komplicerad eftersom olika typer av tumörer uttrycker särskiljande gener och vägar för överlevnad och spridning. Därför kan detta protokoll plocka upp gener som skiljer olika tumörtyper under olika omständigheter. Det finns potential att hitta effektiva strategier mot cancer genom att förstå mekanismen för specifika genuttryck.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie, odlade cancer stem-liknande tumorspheres användes som en modell för att analysera RNAseq data med tillgängliga bioinformatik. För en sjukdom modell, HT29-härledda tumorspheres användes. Eftersom tumörsfärerna har läkemedelsresistens mot tumörterapier kan den etablerade modellen användas för att undersöka de detaljerade mekanismerna för resistens genom att undersöka skillnader i genuttryck. Dessutom ger genomisk teknik som använder RNAseq med tillgängliga bioinformatik snabb förståelse f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Strålbiologi Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, för tekniskt stöd. Denna studie stöddes av bidrag från Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), och Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 och MMH-106-61). Finansieringsorganen hade inget inflytande över utformningen av studien och datainsamling, analys och tolkning av data eller skriftligen manuskriptet.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
