En vejledning til sektions-, coring- og billedbehandling til indkøb og analyse af kortikale knogleeksempeler med høj overførselshastighed til synkrotronmikro-CT
Summary
Vi anvendte en geologisk (coring) prøvetagningsprotokol til at skaffe kortikale knogleprøver af ensartet størrelse til SRμCT-eksperimenter fra det forreste aspekt af menneskelig femora. Denne metode er minimalt destruktiv, effektiv, resulterer i cylindriske prøver, der minimerer billedartefakter fra uregelmæssige prøveformer og forbedrer mikroarkitectural visualisering og analyse.
Abstract
Bone er et dynamisk og mekanisk aktivt væv, der ændrer sig i struktur i løbet af menneskets levetid. Produkterne fra knogleombygningsprocessen er blevet undersøgt væsentligt ved hjælp af traditionelle todimensionelle teknikker. Nylige fremskridt inden for røntgenbilledteknologi via desktop-mikrocomputertomografi (μCT) og synkrotronstråling mikrodatamatiseret tomografi (SRμCT) har gjort det muligt at erhverve tredimensionelle (3D) scanninger i høj opløsning af et større synsfelt (FOV) end andre 3D-billeddannelsesteknikker (f.eks. SEM), der giver et mere komplet billede af mikroskopiske strukturer inden for humane kortikale knoglestrukturer. Prøven skal være præcist centreret i FOV, dog for at begrænse udseendet af streak artefakter kendt for at påvirke dataanalyse. Tidligere undersøgelser har rapporteret indkøb af uregelmæssigt formede retlinede knogleblokke, der resulterer i billeddannelse artefakter på grund af ujævne kanter eller billede afkortning. Vi har anvendt en geologisk prøveudtagningsprotokol (coring) til at skaffe kortikale knoglekerneprøver i konstant størrelse til SRμCT-eksperimenter fra det forreste aspekt af menneskelig femora. Denne coring metode er effektiv og minimalt ødelæggende for væv. Det skaber ensartede cylindriske prøver, der reducerer billeddannelse artefakter af natur af at være isometrisk under rotation og giver en ensartet sti længde for X-ray stråler under hele scanningen. Billedbehandling af røntgentomografiske data fra cored og uregelmæssigt formede prøver bekræfter teknikkens potentiale til at forbedre visualisering og analyse af kortikal knoglemikrarkitektur. Et mål med denne protokol er at levere en pålidelig og repeterbar metode til udvinding af kortikale knoglekerner, der kan tilpasses til forskellige typer knoglebilleddannelseseksperimenter med høj opløsning. Et overordnet mål med arbejdet er at skabe en standardiseret kortikal knogleindkøb for SRμCT, der er overkommelig, konsistent og ligetil. Denne procedure kan yderligere tilpasses af forskere inden for beslægtede områder, der almindeligvis evaluerer hårde kompositmaterialer såsom i biologisk antropologi, geovidenskab eller materialevidenskab.
Introduction
Med de seneste fremskridt inden for billedbehandlingsteknologi er det nu muligt at erhverve røntgenbilleddata med meget høj opløsning. Mikro-CT-systemer til stationære computere (μCT) er den nuværende standard for billeddannelse af cancellous bone på grund af deres ikke-destruktive karakter1. Ved billeddannelse af mikrostrukturelle træk ved kortikale knogler har μCT-brugen imidlertid været mere begrænset. På grund af opløsningsbegrænsninger kan skrivebordssystemer ikke opnå den opløsning, der kræves for at afbilde mikrostrukturelle funktioner, der er mindre end kortikale porer, f.eks. Til denne applikation er SRμCT ideel på grund af den større opløsning af disse systemer1. For eksempel har eksperimenter på den canadiske lyskilde (CLS) på BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) beamlines2 produceret billeder med voxels så små som 0,9 μm. Tidligere undersøgelser1,3,4,5 har brugt denne beslutning til at erhverve fremskrivninger og efterfølgende tredimensionale (3D) gør fra kortikale knogleprøver fra mennesker lange knogler ( Figur1) til at kvantificere osteocyt lacunar tæthed4, 6,7,8,9 og variation i lakuner form og størrelse3 på tværs af den menneskelige levetid og mellem kønnene. Yderligere undersøgelser har vist tilstedeværelsen af osteon banding hos mennesker10, et fænomen, der tidligere blev anerkendt for kun at være forbundet med ikke-menneskelige pattedyr i den retsmedicinske antropologiske litteratur.
For at opnå en ekstraordinær opløsning skal røntgenstrålen være fint fokuseret inden for synsfeltet (FOV), som ofte begrænser den maksimale prøvestørrelse til et par millimeter i diameter. I øjeblikket har der ikke været nogen omfattende, standardiserede procedurer, der er beskrevet i litteraturen, der skitserer knogleprøveindkøb, der opfylder disse begrænsninger. Centrering af prøver i FOV er afgørende for at sikre, at 1) prøven forbliver centreret, da den roterer 180 ° under billeddannelse, og 2) scanningsartefakter er begrænsede, da der ikke er nogen billedafkortning. Med andre ord forstyrrer ingen dele af prøven uden for FOV strålen, der kommer ind i dens omdrejningspunkt inde i FOV. Hvis dette sker, fratages genopbygningsalgoritmen nogle af de afdæmpningsdata, der er nødvendige for en helt korrekt rekonstruktion. Det er endvidere værd at bemærke, at 360 ° (fuld rotation) scanninger minimere virkningerne af strålehærdning, men øge artefakter forårsaget af forskydning og prøve bevægelse under billeddannelse. Mens en 360° scanning typisk genererer renere data, fordobles billedtiden, og derfor skal der tages fat på et kompromis mellem eksperimentelle omkostninger og datakvalitet.
Et vigtigt og ofte overset aspekt af knoglebilleddannelseseksperimenter er den nøjagtige og replikerbare prøveforberedelsesteknik, der udføres før scanning. Undersøgelser, der inkorporerer SRμCT-metoder i deres eksperimenter, nævner kort deres prøveudtagningsprotokol, men forfatterne giver lidt eller ingen detaljer om den særlige metode, der anvendes til at indsamle deres prøver. Mange af disse undersøgelser nævner skærende retlinede knogleblokke af vilkårlige dimensioner, men giver generelt ingen yderligere oplysninger om de anvendte værktøjer eller indlejringsmaterialer3,4,10,11,12,13,14. Nogle forskere bruger almindeligvis håndholdte roterende værktøjer (f.eks. Dremel) til at fjerne retlinede knogleblokke fra en region af interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Denne metode resulterer i prøver i ikke-ensartet størrelse, der kan være større end FOV, hvilket øger sandsynligheden for scanning af artefakter og billedafkortning. Sådanne prøver kræver ofte yderligere raffinering ved hjælp af en præcisionsdiamant-wafersav (f.eks. Buehler Isomet). Fremskaffelse af prøver med konsistente dimensioner (til 200ths/mm) er afgørende for at sikre, at de erhvervede datasæt er af højeste kvalitet, og at de efterfølgende resultater kan gentages.
Den begrænsede rapportering af stikprøveindkøbsmetoden tilføjer et ekstra lag af vanskeligheder, når man forsøger at anvende og/eller validere metoder, der er udført i en tidligere undersøgelse. I øjeblikket skal forskere kontakte forfatterne direkte for at få yderligere oplysninger om deres prøveudtagningsprocedurer. Den protokol, der er beskrevet her, giver biomedicinske forskere en grundigt dokumenteret, replikerbar og omkostningseffektiv prøvetagningsteknik. Det primære formål med denne artikel er at give en omfattende tutorial om, hvordan man skaffer konsekvent størrelse kortikale knoglekerneprøver ved hjælp af en mølle-borepresse og diamant coring bit for nøjagtig visualisering og udvinding af mikroarchitectural data. Denne metode er ændret fra procedurer, der anvendes til rutinemæssigt at indsamle ensartede, små-diameter (1-5 mm) cylindre fra blokke af hårde materialer i højtryks rock mekanik15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der har ikke været nogen omfattende, standardiseret protokol for indkøb af ensartede og cylindriske kortikale knoglekerneprøver til højopløsnings SRμCT-billeddannelse med begrænsede FOV-opsætninger. Protokollen detaljeret her udfylder dette tomrum ved at give en omfattende tutorial om, hvordan man skaffer konsekvent størrelse kortikale knoglekerneprøver til SRμCT billeddannelse og den efterfølgende nøjagtige visualisering og udvinding af mikroarchitectural data. Vi har vist, at vores protokol giver en mere s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning beskrevet i dette papir blev udført på BMIT facilitet på den canadiske Light Source, som støttes af Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, Western Economic Diversificering Canada, National Research Council Canada, og den canadiske Institutes of Health Research. Forfatterne vil gerne takke beamline forskere ved den canadiske Light Source, især Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov, og Ning Zu for bistand i opsætning og fejlfinding af SkyScan SRμCT og hvid stråle mikroskop systemer. Vi vil også gerne takke Beth Dalzell fra University of Toledo College of Medicine and Life Sciences og Dr. Jeffrey Wenstrup fra Northeast Ohio Medical University for adgang til kadaverprøver til denne undersøgelse. JM Andronowski støttes gennem opstartsforskningsmidler fra University of Akron og et Nationalt Institut for Retfærdighedsforskning og -udvikling inden for retsvidenskab til strafferetlige formål (2018-DU-BX-0188). RA Davis er støttet af en kandidat assistent fra The University of Akron. Udstyr og forsyninger, der anvendes til coring og savning blev købt af start-up midler fra The University of Akron og NSF tilskud EAR-1624242 til CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
