Руководство по секционной обработке, корингу и обработке изображений для закупок и анализа образцов высокой пропускной способности кортикальной кости для синхротронной микро-CT
Summary
Мы использовали геологический (коринг) протокол отбора проб для закупки образцов корковых костей одинакового размера для экспериментов SR-CT с переднего аспекта бедренной кости человека. Этот метод является минимально разрушительным, эффективным, приводит к цилиндрическим образцам, которые минимизируют артефакты изображений из нерегулярных форм образца и улучшают микроархитектурную визуализацию и анализ.
Abstract
Кость является динамичной и механически активной тканью, которая изменяется в структуре в течение всего срока службы человека. Продукты процесса ремоделирования костей были изучены с использованием традиционных двумерных методов. Недавние достижения в области технологии рентгеновской визуализации с помощью настольной микро-компьютерной томографии (КТ) и синхротронной радиационной микро-компьютерной томографии (СРЗКТ) позволили получить трехмерное (3D) сканирование трехмерного (3D) высокого разрешения более широкого поля зрения (FOV), чем другие методы 3D-изображения (например, SEM), обеспечивающие более полную картину микроскопических структур в человеческой кости. Образец должен быть точно по центру в FOV, однако, чтобы ограничить появление полос артефактов, как известно, влияние анализа данных. Предыдущие исследования сообщили о закупке неправильной формы ректилинейных блоков костей, которые приводят к визуализации артефактов из-за неравномерных краев или утончения изображения. Мы применили протокол геологической выборки (коринг) для закупки последовательно размера образцов коркового костного ядра для экспериментов SR-CT из переднего аспекта бедренной кости человека. Этот метод coring эффективен и минимально разрушительн к ткани. Он создает однородные цилиндрические образцы, которые уменьшают артефакты изображений по своей природе быть изометрическим во время вращения и обеспечивают единую длину пути для рентгеновских лучей во время сканирования. Обработка рентгеновских томографических данных образцов кора и неправильной формы подтверждает потенциал методики улучшения визуализации и анализа микроархитектуры корковой кости. Цель этого протокола заключается в предоставлении надежного и повторяемого метода для извлечения корковых костных ядер, который адаптируется для различных типов экспериментов по визуализации костей высокого разрешения. Главной целью работы является создание стандартизированной закупки корковых костей для SR-CT, которая является доступной, последовательной и простой. Эта процедура может быть дополнительно адаптирована исследователями в смежных областях, которые обычно оценивают твердые композитные материалы, такие как биологическая антропология, геонауки или материаловедения.
Introduction
С последними достижениями в области технологии визуализации, в настоящее время возможно получить рентгеновские данные изображения с очень высоким разрешением. Настольные микро-CT (КТ) системы являются текущим стандартом для изображения канцелятной кости из-за их неразрушающая природа1. Однако при визуализации микроструктурных особенностей корковой кости использование КТ было более ограниченным. Из-за ограничений разрешения настольные системы не могут достичь разрешения, необходимого для изображения микроструктурных объектов меньше корковых пор, таких как остеоциты лакуны. Для этого приложения, SR-CT идеально подходит из-за большего разрешения этих систем1. Например, эксперименты в Канадском источнике света (CLS) на бимеймической визуализации и терапии (BMIT)2 дали изображения с воксельами всего 0,9 мкм. Предыдущиеисследования 1,3,4,5 использовали это разрешение для приобретения проекций и последующих трехмерных (3D) оказывает из корковых образцов кости из человеческих длинных костей (Рисунок 1) для количественной оценки плотности остоцитов лакунар4,6,7,8,9 и изменения в форме лакунара и размер3 на протяжении всей жизни человека и между полами. Дальнейшие исследования показали наличие остеона бандинга улюдей 10, явление, ранее признанное связанным только с нечеловеческими млекопитающими в судебной антропологической литературе.
Для достижения исключительного разрешения рентгеновский луч должен быть тонко сфокусирован в поле зрения (FOV), что часто ограничивает максимальный размер образца несколькими миллиметрами в диаметре. В настоящее время в литературе не было описано всеобъемлющих, стандартизированных процедур, описывающих закупки образцов костей, которые соответствовали бы этим ограничениям. Центрирование образцов в FOV имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы 1) образец остается по центру, как он вращается на 180 “во время изображения, и 2) сканирование артефактов ограничены, так как нет укоренения изображения. Другими словами, никакие части образца за пределами FOV не мешают пучку войти в его координационный центр внутри FOV. Если это происходит, алгоритм реконструкции лишается некоторых данных об затухания, необходимых для полностью правильной реконструкции. Кроме того, стоит отметить, что сканирование на 360 градусов (полное вращение) сводит к минимуму последствия затвердевания пучка, но увеличивает артефакты, вызванные нестолкнения и движения образца во время визуализации. Таким образом, в то время как сканирование на 360 градусов, как правило, генерирует более чистые данные, время обработки изображений удваивается, и поэтому необходимо решить вопрос о компромиссе между экспериментальными затратами и качеством данных.
Важным и часто упускается из виду аспект экспериментов костной визуализации является точная и реплицируемая техника подготовки образцов, выполненная до сканирования. В исследованиях, которые включают методы СРЗКТ в свои эксперименты, кратко упоминается их протокол отбора проб, однако авторы практически не сообщают подробностей о конкретной методологии, используемой для сбора их образцов. Во многих таких исследованиях упоминается резка ректилинейных костных блоков произвольных размеров, но в целом не дают никакой дополнительной информации обинструментах или встраивающихматериалах,используемых 3, 4,10,11,12,13,14. Некоторые исследователи обычно используют портативные роторные инструменты (например, Dremel) для удаления ректилинейных блоков кости из области интересов (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Этот метод приводит к неуниформенные выборки, которые могут быть больше, чем FOV, увеличивая вероятность сканирования артефактов и умножения изображения. Такие образцы часто требуют дальнейшей переработки с использованием точной алмазно-вафельной пилы (например, Бюлера Изомета). Закупка образцов с согласованными размерами (до двухсот/мм) имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы приобретенные наборы данных были самого высокого качества и последующие результаты были реплицируемы.
Ограниченная отчетность методологии выборочных закупок добавляет дополнительный уровень сложности при попытке использовать и/или проверять методы, выполненные в предыдущем исследовании. В настоящее время исследователи должны связаться с авторами непосредственно для получения дополнительной информации об их процедурах отбора проб. Протокол, подробно описанный здесь, предоставляет биомедицинским исследователям тщательно документированный, реплицируемый и экономичный метод отбора проб. Основная цель этой статьи заключается в предоставлении всеобъемлющего учебника о том, как закупать последовательно размера корковых образцов костного ядра с использованием мельничного пресса и алмазного коринга бит для точной визуализации и извлечения микроархитектуральных данных. Этот метод модифицирован из процедур, используемых для регулярного сбора однородных цилиндров малого диаметра (1-5 мм) из блоков твердых материаловв механике пород высокого давления 15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Не было никакого всеобъемлющего, стандартизированного протокола для закупки однородных и цилиндрических образцов корковой кости для изображения СРЗКТ высокого разрешения с ограниченными установками FOV. Протокол, подробно описанный здесь, заполняет эту пустоту, предоставляя всеобъе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, описанные в настоящем документе, были проведены на объекте BMIT в Канадском источнике света, который поддерживается Канадским фондом инноваций, естественных наук и инженерных исследований Совета Канады, Университета Саскачевана, правительства Саскачевана, Западной экономической диверсификации Канады, Национального исследовательского совета Канады и Канадских институтов исследований в области здравоохранения. Авторы хотели бы поблагодарить ученых-лучей из Канадского источника света, в частности Адама Уэбба, Дениз Миллер, Сергея Гасилова и Нин Цу за помощь в настройке и устранении неполадок в системах SkyScan SR-CT и микроскопов белого луча. Мы также хотели бы поблагодарить Бет Dalzell из Университета Толедо колледжа медицины и наук о жизни и д-р Джеффри Wenstrup из Северо-Восточного Огайо медицинский университет для доступа к трупных образцов для этого исследования. JM Andronowski поддерживается за счет стартовых научно-исследовательских фондов, предоставляемых Университетом Акрона и Национальным институтом исследований и разработок в области судебной медицины для целей уголовного правосудия грант (2018-DU-BX-0188). РА Дэвис поддерживается аспирантом, предоставленным Университетом Акрона. Оборудование и материалы, используемые для coring и распиливания были приобретены на стартовые средства, предоставленные Университетом Акрона и NSF грант EAR-1624242 для CW Холиок.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
