Un guide de sectionnement, de coring et de traitement d’image pour l’approvisionnement et l’analyse d’échantillons d’os cortical à haut débit pour le micro-CT synchrotron
Summary
Nous avons utilisé un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens d’os corticals de taille uniforme pour les expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode est minimalement destructrice, efficace, se traduit par des spécimens cylindriques qui minimisent l’imagerie des artefacts à partir de formes d’échantillons irrégulières et améliore la visualisation et l’analyse microarchitecturales.
Abstract
L’os est un tissu dynamique et mécaniquement actif qui change de structure au cours de la durée de vie humaine. Les produits du processus de remodelage d’os ont été étudiés substantiellement utilisant les techniques bidimensionnelles traditionnelles. Les progrès récents de la technologie d’imagerie aux rayons X par l’intermédiaire de la tomographie micro-calculée de bureau (μCT) et de la tomographie micro-calculée par rayonnement synchrotron (SRμCT) ont permis l’acquisition de balayages tridimensionnels à haute résolution (3D) d’un plus grand champ de vision (FOV) que d’autres techniques d’imagerie 3D (p. ex., SEM) fournissant une image plus complète des structures microscopiques dans l’os cortical humain. Toutefois, le spécimen doit être centré avec précision à l’intérieur du FOV afin de limiter l’apparence des artefacts de stries connus pour avoir un impact sur l’analyse des données. Des études antérieures ont signalé l’achat de blocs osseux rectilinaires de forme irrégulière qui entraînent des artefacts d’imagerie en raison de bords inégaux ou de troncature d’image. Nous avons appliqué un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens de carottes osseuses corticales de taille constante pour des expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode de carottage est efficace et minimalement destructrice pour les tissus. Il crée des échantillons cylindriques uniformes qui diminuent les artefacts d’imagerie par nature d’être isométrique pendant la rotation et de fournir une longueur de chemin uniforme pour les faisceaux de rayons X tout au long de la numérisation. Le traitement d’image des données tomographiques de rayon X des échantillons cored et irrégulièrement formés confirme le potentiel de la technique pour améliorer la visualisation et l’analyse de la microarchitecture corticale d’os. L’un des objectifs de ce protocole est de fournir une méthode fiable et reproductible pour l’extraction de noyaux d’os corticals adaptables à divers types d’expériences d’imagerie osseuse à haute résolution. Un objectif global du travail est de créer un approvisionnement normalisé d’os cortical pour SRμCT qui est abordable, cohérent, et simple. Cette procédure peut en outre être adaptée par des chercheurs dans des domaines connexes qui évaluent généralement des matériaux composites durs tels que dans l’anthropologie biologique, les géosciences, ou les sciences des matériaux.
Introduction
Avec les progrès récents de la technologie d’imagerie, il est maintenant possible d’acquérir des données d’imagerie par rayons X avec une très haute résolution. Les systèmes de micro-CT de bureau (μCT) sont la norme actuelle pour l’imagerie des os cancellous en raison de leur nature non destructive1. Quand les dispositifs microstructuraux de formation image de l’os cortical, cependant, l’utilisation de μCT a été plus limitée. En raison de contraintes de résolution, les systèmes de bureau ne peuvent pas atteindre la résolution requise pour l’image des caractéristiques microstructurales plus petites que les pores corticals, tels que les lacunae ostéocytes. Pour cette application, SRμCT est idéal en raison de la plus grande résolution de ces systèmes1. Par exemple, des expériences menées à la Source lumineuse canadienne (CLS) sur les lignes de faisceaux d’imagerie et de thérapie biomédicales (BMIT)2 ont produit des images avec des voxels aussi petits que 0,9 μm. Des étudesantérieures 1,3,4,5 ont utilisé cette résolution pour acquérir des projections et des rendus tridimensionnels subséquents (3D) à partir de spécimens d’os corticals provenant d’os longs humains ( figure1) pour quantifier la densité lacunaire ostéocyte4,6,7,8,9 et la variation de la forme lacunaire et de la taille3 à travers la durée de vie humaine et entre les sexes. D’autres études ont démontré la présence de baguage d’ostéonchez l’homme 10, un phénomène précédemment reconnu pour être associé à seulement les mammifères non humains dans la littérature anthropologique médico-légale.
Afin d’obtenir une résolution exceptionnelle, le faisceau de rayons X doit être finement concentré dans le champ de vision (FOV), ce qui limite souvent la taille maximale du spécimen à quelques millimètres de diamètre. À l’heure actuelle, il n’y a pas eu de procédures complètes et normalisées décrites dans la documentation décrivant l’approvisionnement en échantillons d’os qui répondent à ces restrictions. Il est essentiel de centrer les spécimens à l’intérieur du FOV pour s’assurer que 1) l’échantillon reste centré pendant qu’il tourne à 180° pendant l’imagerie, et 2) les artefacts de balayage sont limités puisqu’il n’y a pas de troncature d’image. En d’autres termes, aucune partie de l’échantillon à l’extérieur du FOV n’interfère avec le faisceau entrant dans son point focal à l’intérieur du FOV. Si cela se produit, l’algorithme de reconstruction est privé de certaines des données d’atténuation nécessaires pour une reconstruction entièrement correcte. Il est également intéressant de noter que les balayages à 360° (rotation complète) minimisent les effets du durcissement du faisceau, mais augmentent les artefacts causés par le désalignement et le mouvement de l’échantillon pendant l’imagerie. Ainsi, alors qu’une analyse à 360° génère généralement des données plus propres, le temps d’imagerie est doublé et un compromis entre coût expérimental et qualité des données doit donc être abordé.
Un aspect important et souvent négligé des expériences d’imagerie osseuse est la technique précise et reproductible de préparation des spécimens effectuée avant la numérisation. Les études qui intègrent les méthodes SRμCT dans leurs expériences mentionnent brièvement leur protocole d’échantillonnage, mais les auteurs fournissent peu ou pas de détails sur la méthodologie particulière utilisée pour recueillir leurs spécimens. Beaucoup de ces études mentionnent la coupe des blocs rectilinaires d’os de dimensions arbitraires, mais ne fournissent généralement aucune autre information sur les outils ou les matériauxd’intégration utilisés 3,4,10,11,12,13,14. Certains chercheurs utilisent couramment des outils rotatifs portatifs (p. ex., Dremel) pour enlever les blocs rectilinaires d’os d’une régiond’intérêt(ROI)3,4,10,11,12,13,14. Cette méthode se traduit par des échantillons de taille non uniforme qui peuvent être plus grands que le FOV, augmentant la probabilité de scanner des artefacts et de tronquer l’image. Ces spécimens nécessitent souvent un raffinage plus important à l’aide d’une scie à gaufrettes de précision (p. ex., Buehler Isomet). Il est essentiel d’obtenir des échantillons aux dimensions cohérentes (jusqu’aux deux centièmes/mm) pour s’assurer que les ensembles de données acquis sont de la plus haute qualité et que les résultats subséquents sont reproductibles.
La production limitée de rapports sur la méthodologie d’approvisionnement des échantillons ajoute une couche supplémentaire de difficulté lorsqu’on tente d’employer et/ou de valider les méthodes effectuées dans une étude antérieure. À l’heure actuelle, les chercheurs doivent communiquer directement avec les auteurs pour obtenir de plus amples détails sur leurs procédures d’échantillonnage. Le protocole détaillé ici fournit aux chercheurs biomédicaux une technique d’échantillonnage soigneusement documentée, reproductible et rentable. L’objectif principal de cet article est de fournir un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante à l’aide d’une presse à forer et d’un morceau de carottage de diamants pour la visualisation et l’extraction précises des données microarchitecturales. Cette méthode est modifiée à partir de procédures utilisées pour recueillir régulièrement uniforme, petit diamètre (1-5 mm) cylindres à partir de blocs de matériaux durs dans la mécanique de roche àhaute pression 15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il n’y a pas eu de protocole complet et normalisé pour l’achat d’échantillons de carottes corticales uniformes et cylindriques pour l’imagerie SRμCT haute résolution avec des configurations FOV limitées. Le protocole détaillé ici comble ce vide en fournissant un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante pour l’imagerie SRμCT et la visualisation et l’extraction précises subséquentes des données microarchitecturales. Nous avons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches décrites dans cet article ont été effectuées à l’installation bmit de la Source lumineuse canadienne, qui est appuyée par la Fondation canadienne pour l’innovation, les sciences naturelles et le Conseil de recherches en génie du Canada, l’Université de la Saskatchewan, le gouvernement de la Saskatchewan, Diversification de l’économie occidentale Canada, le Conseil national de recherches du Canada et les Instituts de recherche en santé du Canada. Les auteurs aimeraient remercier les scientifiques de la ligne de faisceau à la Source lumineuse canadienne, en particulier Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov et Ning Zu pour leur aide dans la mise en place et le dépannage des systèmes de microscope SkyScan SRμCT et à faisceau blanc. Nous tenons également à remercier Beth Dalzell de l’Université de Toledo College of Medicine and Life Sciences et le Dr Jeffrey Wenstrup de l’Université médicale du Nord-Est de l’Ohio pour l’accès à des échantillons cadavériques pour cette étude. JM Andronowski est soutenu par des fonds de recherche de démarrage fournis par l’Université d’Akron et une subvention de l’Institut national de recherche et de développement de la justice en sciences judiciaires à des fins de justice pénale (2018-DU-BX-0188). RA Davis est soutenu par un poste d’assistant diplômé fourni par l’Université d’Akron. L’équipement et les fournitures utilisés pour le carottage et le sciage ont été achetés par des fonds de démarrage fournis par l’Université d’Akron et la subvention de la FNS EAR-1624242 à CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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