Separation av bioaktiva små molekyler, peptider från naturliga källor och proteiner från mikrober med Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metod
Summary
Målet är att fraktionera och isolera bioaktiva små molekyler, peptider från ett komplext växtextrakt och proteiner från patogena mikrober genom att använda ief-metoden (liquid-phase isoelectric focusing). Vidare identifierades de separerade molekylerna och deras bioaktivitet bekräftades.
Abstract
Naturliga produkter som härrör från växter och mikrober är en rik källa till bioaktiva molekyler. Före användningen måste de aktiva molekylerna från komplexa extrakt renas för nedströmsapplikationer. Det finns olika kromatografiska metoder tillgängliga för detta ändamål men inte alla laboratorier har råd med högpresterande metoder och isolering från komplexa biologiska prover kan vara svårt. Här visar vi att preparativ vätskefas isoelektrisk fokusering (IEF) kan separera molekyler, inklusive små molekyler och peptider från komplexa växtextrakt, baserat på deras isoelektriska punkter (pI). Vi har använt metoden för komplexa biologiska provfraktionering och karakterisering. Som ett proof of concept, fraktionerade vi en Gymnema sylvestre växtextrakt, isolera en familj av terpenoid saponin små molekyler och en peptid. Vi visade också effektiv mikrobiell proteinseparation med Candida albicans svamp som modellsystem.
Introduction
Rening av biomolekyler från komplexa biologiska prover är ett viktigt och ofta svårt steg i biologiska experiment1. Isoelektrisk fokusering (IEF) är väl lämpad för högupplöst separation av komplexa biomolekyler där bäraramkulterna färdas enligt deras laddning och upprättar pH-lutningen i ett elektriskt fält3. Den första kommersiella transportören ampholyte för IEF utvecklades av Olof Vesterberg 1964 och patenterade4,5. Bärarens ampholyter är alifatiska oligo-amino oligo-karboxylsyra molekyler av varierande längd och förgrening6. Därefter förbättrade Vesterberg m.fl.6,7
Metoder för att separera biomolekyler inkluderar agaros och polyakrylamid gel elektrofores, tvådimensionell gel elektrofores (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillär elektrofores, isotachophoresis och andra kromatografiska tekniker (t.ex., TLC, FPLC, HPLC)2. IEF i flytande fas som utfördes i ett instrument som kallas “Rotofor” uppfanns av Milan Bier8. Han banade väg för konceptet och designen av detta instrument och bidrog i stor utsträckning till teorin om elektroforesisk migration. Hans team utvecklade också en matematisk modell av elektroforesisk separationsprocess för datorsimuleringar9.
IEF-apparaten i flytande fas är en horisontellt roterande cylindrisk cell bestående av en nylonkärna uppdelad i 20 porösa fack och en cirkulerande vattenkylning keramisk stång. De porösa kamrarna gör det möjligt för molekyler att migrera genom vattenfasen mellan elektroderna och tillåta insamling av renade prover under vakuum i fraktioner. Detta reningssystem kan ge upp till 1000-faldig rening av en specifik molekyl i <4 timmar. Ett värdefullt inslag i detta instrument är att det kan tillämpas som ett första steg för rening från en komplex blandning eller som ett sista steg för att uppnå renhet10. Om molekylen av intresse är ett protein, en annan fördel är att dess inhemska konformation kommer att upprätthållas under separationen.
Användningen av vätskefas IEF har rapporterats i stor utsträckning för proteiner, enzymer och antikroppsrening6,,10,,11,12,13,14. Här beskriver vi användningen av detta tillvägagångssätt för att separera och rena små molekyler och peptider från medicinalväxten Gymnema sylvestre. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare att koncentrera och rena aktiva små molekyler från ett växtextrakt för nedströms applikationer till låg kostnad. Dessutom visar vi också att anrikning av proteiner från ett komplext proteinextrakt från Candida albicans svamp15 i detta IEF-baserade system som ett andra exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Små molekyler från naturliga produktkällor (t.ex. växter) inkluderar komplexa sekundära metaboliter som är mycket olika i kemisk struktur. De tros vara inblandade i växtförsvarsmekanismer. Dessutom finns polypeptider också iväxtvävnader 22. Dessa naturliga produkt små molekyler är rika källor till testmolekyler för läkemedelsupptäckt och utveckling. De svåra och tråkiga metoder som krävs för deras isolering och rening begränsar dock deras användning för terapeutiska tilläm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för finansieringskällorna från Avdelningen för biologi och Johnson Cancer Research Center för BRIEF och IRA utmärkelser, respektive till GV. Vi tackar också K-INBRE postdoc award till RV. Detta arbete stöddes delvis av Institutional Development Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20 GM103418. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna hos National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi tackar anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
