Отделение биологически активных малых молекул, пептиды из природных источников и белки от микробов по методу preparative Isoelectric Focusing (IEF)
Summary
Цель состоит в том, чтобы дробить и изолировать биологически активные мелкие молекулы, пептиды из сложного растительного экстракта и белки из патогенных микробов, используя жидко-фазный изоэлектрический метод фокусировки (IEF). Кроме того, были идентифицированы разделенные молекулы и подтверждена их биоактивность.
Abstract
Натуральные продукты, полученные из растений и микробов, являются богатым источником биологически активных молекул. Перед их использованием активные молекулы из сложных экстрактов должны быть очищены для применения ниже по течению. Существуют различные хроматографические методы, доступные для этой цели, но не все лаборатории могут позволить себе методы высокой производительности и изоляции от сложных биологических образцов может быть трудно. Здесь мы демонстрируем, что preparative liquid-phase isoelectric focusing (IEF) может отделять молекулы, в том числе небольшие молекулы и пептиды из сложных растительных экстрактов, на основе их изоэлектрических точек (pI). Мы использовали метод для сложной фракционации и характеристики биологических образцов. В качестве доказательства концепции, мы дроболовый экстракт Гимнема сильвестр растений, изолируя семейство терпеноидных сапонин малых молекул и пептид. Мы также продемонстрировали эффективное разделение микробного белка с использованием грибка Candida Albicans в качестве модели системы.
Introduction
Очистка биомолекулы из сложных биологических образцов является важным и часто трудным шагом в биологических экспериментах1. Изоэлектрическая фокусировка (IEF) хорошо подходит для разделения высокого разрешения сложных биомолекул, где несущая амфолиты путешествуют в соответствии с их зарядом и устанавливают градиент рН в электрическом поле3. Первый коммерческий авиаперевозчик для IEF был разработан Улофом Вестербергом в 1964 году и запатентовал4,5. Перевозчик амфолиты алифатические олиго-амино олиго-карбокслихиловой кислоты молекул различной длины и ветвящихся6. Впоследствии Вестерберг и другие улучшили перевозчик амфолитов для их расширенного использования в разделении биомолекул6,7.
Методы разделения биомолекул включают агарозу и полиакриламинид гель электрофорез, двухмерный гель электрофорез (2-DE), изоэлектрической фокусировки, капиллярный электрофорез, изотахофорез и другие хроматографические методы (например, TLC, FPLC, HPLC)2. Ликвид-фазный IEF, выполненный в инструменте под названием “Rotofor”, был изобретен Миланом Биром8. Он был инициатором концепции и дизайна этого инструмента и внес значительный вклад в теорию электрофоретической миграции. Его команда также разработала математическую модель электрофоретического процесса разделения для компьютерного моделирования9.
Аппарат IEF-фазы является горизонтально вращающейся цилиндрической ячейкой, состоящей из нейлонового ядра, разделенного на 20 пористых отсеков и циркулирующего керамического стержня для охлаждения воды. Пористие камеры позволяют молекулам мигрировать через аквеи между электродами и позволяют сбор очищенных образцов под вакуумом в фракциях. Эта система очистки может обеспечить до 1000-кратное очищение конкретной молекулы в Зтт;4 часа. Ценной особенностью этого инструмента является то, что он может быть применен в качестве первого шага для очистки от сложной смеси или в качестве заключительного шага для достижения чистоты10. Если молекулой интереса является белок, еще одним преимуществом является то, что его родная конформация будет поддерживаться во время разделения.
Использование жидко-фазы IEF было широко сообщено для белков, ферментов и очищения антител6,,10,,11,12,13,14. Здесь мы описываем использование этого подхода для разделения и очистки малых молекул и пептидов от лекарственного растения Gymnema sylvestre. Этот протокол поможет исследователям сконцентрировать и очистить активные малые молекулы из растительного экстракта для приложений ниже по течению по низкой цене. Кроме того, мы также демонстрируем, что обогащение белков из сложного белкового экстракта из гриба Candida albicans 15 в этой системе на основе IEF в качестве второго примера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Небольшие молекулы из натуральных источников продукта (например, растения) включают сложные вторичные метаболиты, которые очень разнообразны в химической структуре. Считается, что они участвуют в механизмах защиты растений. Кроме того, полипептиды также присутствуют в тканях растени?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за источники финансирования из Отдела биологии и Джонсона онкологический научный центр BRIEF и ИРА награды, соответственно, GV. Мы также благодарим K-INBRE постдокторской награды Р.В. Эта работа была частично поддержана Премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантовым номером P20 GM103418. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института общих медицинских наук или Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим анонимных рецензентов за их полезные комментарии.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
