Séparation des petites molécules bioactives, peptides des sources naturelles et des protéines des microbes par la méthode de mise au point isoélectrique préparative (IEF)
Summary
L’objectif est de fractionner et d’isoler les petites molécules bioactives, les peptides d’un extrait de plante complexe et les protéines de microbes pathogènes en utilisant la méthode de mise au point isoélectrique (IEF) en phase liquide. En outre, les molécules séparées ont été identifiées et leur bioactivité confirmée.
Abstract
Les produits naturels dérivés des plantes et des microbes sont une riche source de molécules bioactives. Avant leur utilisation, les molécules actives provenant d’extraits complexes doivent être purifiées pour des applications en aval. Il existe diverses méthodes chromatographiques disponibles à cette fin, mais tous les laboratoires ne peuvent pas se permettre des méthodes de haute performance et l’isolement des échantillons biologiques complexes peut être difficile. Nous démontrons ici que la mise au point isoélectrique en phase liquide préparative (IEF) peut séparer les molécules, y compris les petites molécules et les peptides à partir d’extraits de plantes complexes, en fonction de leurs points isoélectriques (pI). Nous avons utilisé la méthode pour la fractionnement et la caractérisation des échantillons biologiques complexes. Comme preuve de concept, nous avons fractionné un extrait de plante gymnema sylvestre, isolant une famille de petites molécules de saponine terpénoïde et un peptide. Nous avons également démontré une séparation efficace des protéines microbiennes en utilisant le champignon Candida albicans comme système modèle.
Introduction
La purification des biomolécules à partir d’échantillons biologiques complexes est une étape essentielle et souvent difficile dans les expériences biologiques1. La mise au point isoélectrique (IEF) convient bien à la séparation à haute résolution des biomolécules complexes où les ampholytes de transport voyagent selon leur charge et établissent le gradient de pH dans un champ électrique3. Le premier amphlyte de transporteur commercial pour IEF a été développé par Olof Vesterberg en 1964 et breveté4,5. Les amplyantes porteuses sont des molécules d’acide oligo-carboxylique oligo-amino aliphatique de longueur variable et de branchement6. Par la suite, Vesterberg et d’autres ont amélioré les ampholytes de support pour leur utilisation accrue dans la séparation des biomolécules6,7.
Les méthodes de séparation des biomolécules comprennent l’électrophorèse de gel d’agarose et de polyacrylamide, l’électrophorèse bidimensionnelle de gel (2-DE), la mise au point isoélectrique, l’électrophorèse capillaire, l’énoachhoresis et d’autres techniques chromatographiques (par exemple, TLC, FPLC, HPLC)2. La phase liquide IEF réalisée dans un instrument appelé « Rotofor » a été inventé par Milan Bier8. Il a été le pionnier du concept et de la conception de cet instrument et a largement contribué à la théorie de la migration électrophorétique. Son équipe a également développé un modèle mathématique de processus de séparation électrophorétique pour les simulations informatiques9.
L’appareil IEF de phase liquide est une cellule cylindrique à rotation horizontale composée d’un noyau de nylon divisé en 20 compartiments poreux et d’une tige en céramique de refroidissement de l’eau circulante. Les chambres poreuses permettent aux molécules de migrer à travers la phase aqueuse entre les électrodes et permettent la collecte d’échantillons purifiés sous vide en fractions. Ce système de purification peut fournir jusqu’à 1000 fois la purification d’une molécule spécifique en <4 heures. Une caractéristique précieuse de cet instrument est qu’il peut être appliqué comme une première étape pour la purification à partir d’un mélange complexe ou comme une dernière étape pour atteindre la pureté10. Si la molécule d’intérêt est une protéine, un autre avantage est que sa conformation native sera maintenue pendant la séparation.
L’utilisation de la phase liquide IEF a été largement rapportée pour les protéines, les enzymes et la purification des anticorps6,10,11,12,13,14. Ici, nous décrivons l’utilisation de cette approche pour séparer et purifier les petites molécules et peptides de la plante médicinale Gymnema sylvestre. Ce protocole aidera les chercheurs à concentrer et à purifier les petites molécules actives à partir d’un extrait de plante pour des applications en aval à faible coût. En outre, nous démontrons également que l’enrichissement des protéines à partir d’un extrait de protéine complexe de Candida albicans champignon15 dans ce système basé sur l’IEF comme un deuxième exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les petites molécules provenant de sources naturelles de produits (p. ex., les plantes) comprennent des métabolites secondaires complexes qui sont très divers dans la structure chimique. On pense qu’ils sont impliqués dans les mécanismes de défense des plantes. En outre, les polypeptides sont également présents dans les tissus végétaux22. Ces petites molécules naturelles sont de riches sources de molécules d’essai pour la découverte et le développement de médicaments. Cependant,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour les sources de financement de la Division de biologie et Johnson Cancer Research Center pour BRIEF et IRA prix, respectivement à GV. Nous remercions également le prix postdoctoral K-INBRE à RV. Ce travail a été soutenu en partie par le Prix de développement institutionnel (IDeA) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20 GM103418. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut national des sciences médicales générales ou des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions les examinateurs anonymes pour leurs commentaires utiles.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
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