प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक रोकथाम सेटिंग में Zika जैसे दिए गए वायरस के लिए एडीज एजिप्टी मच्छर आबादी की वेक्टर क्षमता निर्धारित कर सकता है ।
प्रस्तुत प्रक्रियाओं में संक्रमण की दर, प्रसारित संक्रमण, और प्रश्न में मच्छरों की आबादी में वायरस के संभावित संचरण का निर्धारण करने के लिए प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत जीका वायरस के साथ एडीज एजिप्टी मच्छरों को संक्रमित करने के लिए एक सामान्यीकृत पद्धति का वर्णन किया गया है । इन प्रक्रियाओं का व्यापक रूप से विश्व स्तर पर वेक्टर क्षमता मूल्यांकन में विभिन्न संशोधनों के साथ उपयोग किया जाता है। वे संभावित भूमिका का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हैं कि किसी दिए गए मच्छर (यानी, प्रजातियां, जनसंख्या, व्यक्ति) किसी दिए गए एजेंट के संचरण में खेल सकते हैं।
वेक्टर क्षमता को प्रजातियों, जनसंख्या और यहां तक कि एक व्यक्ति के स्तर पर क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है, जैसे मच्छर, टिक, या फ्लेबोटोमाइन रेत फ्लाई, आर्थ्रोपोड1,2में प्रतिकृति या विकास के साथ जैविक रूप से एक एजेंट को प्राप्त करने और संचारित करने के लिए। मच्छरों और आर्थ्रोपोड-जनित वायरस (यानी, आर्बोवायरस) के संबंध में, एजेंट को मादा मच्छर द्वारा एक विरेमिक होस्ट से आत्मसात किया जाता है। घूस के बाद, वायरस को मिडगुट एपिथेलियल कोशिकाओं 3 की एक छोटी आबादी में से एक को उत्पादक रूप से संक्रमित करना चाहिए, पाचन एंजाइमों द्वारा प्रोटियोलिटिक क्षरण, माइक्रोबायोटा (मिडगुट संक्रमण बाधा, या एमआईबी) की उपस्थिति और स्रावित पेरिट्रोफिक मैट्रिक्स जैसी विभिन्न शारीरिक बाधाओं परकाबूपाना चाहिए। मिडगुट एपिथेलियम के संक्रमण के बाद वायरस की प्रतिकृति और अंततः मच्छर की खुली संचार प्रणाली, या हीमोलिम्फ में मिडगुट से बच जाना चाहिए, जो मिडगुट एस्केप बैरियर (एमईबी) पर काबू पाने वाले प्रसारित संक्रमण की शुरुआत का प्रतिनिधित्व करता है। इस बिंदु पर वायरस माध्यमिक ऊतकों (जैसे, नसों, मांसपेशियों, और वसा निकायों) के संक्रमण को स्थापित कर सकता है और दोहराने के लिए जारी रख सकता है, हालांकि लार ग्रंथियों (लार ग्रंथि संक्रमण बाधा पर काबू पाने) की acinar कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस तरह के माध्यमिक प्रतिकृति वायरस के लिए सख्ती से आवश्यक नहीं हो सकता है। लार ग्रंथि से कोशिकाओं को उनके एपिकल गुहाओं में ले जाते हैं और फिर लार वाहिनी में आवाजाही करने से वायरस का टीका काटने पर बाद के मेजबानों में होता है और संचरणचक्र 1 ,2, 4,5,6,7को पूराहोताहै ।
मच्छर वेक्टर के भीतर प्रसार के इस अच्छी तरह से विशेषता और आम तौर पर संरक्षित तंत्र को देखते हुए, प्रयोगशाला वेक्टर क्षमता मूल्यांकन अक्सर पद्धति से समान होते हैं, हालांकि प्रोटोकॉल में अंतर1,2मौजूद है। आम तौर पर, मौखिक वायरस के संपर्क में आने के बाद, मच्छरों को विच्छेदित किया जाता है ताकि मिडगट, पैर, अंडाशय या लार ग्रंथियों जैसे व्यक्तिगत ऊतकों को वायरल संक्रमण, प्रसारित संक्रमण, प्रसारित संक्रमण/संभावित ट्रांसोवेरियल ट्रांसमिशन, और प्रसारित संक्रमण/संभावित संचरण क्षमता, क्रमशः8के लिए किया जा सके । लार ग्रंथियों में एक वायरस की उपस्थिति, हालांकि, संचरण क्षमता का निश्चित सबूत नहीं है, कुछ वेक्टर/वायरस संयोजनों में लार ग्रंथि से बचने/एग्रेस बैरियर (एसजीईबी) के सबूत दिए गए हैं1,2,4,5,7, 9। संचरण क्षमता को सिद्ध करने की मानक विधि 10,11 ,12अतिसंवेदनशील पशुओं में मच्छरों का संचरणरहताहै . हालांकि, यह देखते हुए कि कई आर्बोवायरस के लिए यह इम्यूनोसमझौतामुरीन मॉडल13, 14,15,16के उपयोग की आवश्यकता है, यह विधि अक्सर लागत-निषेधात्मक होती है। आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला विकल्प मच्छर लार का संग्रह है, जिसका विश्लेषण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) या वायरल जीनोम या संक्रामक कणों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए एक संक्रामक परख द्वारा किया जा सकता है। यह देखने लायक है कि इस तरह के इन विट्रो लार संग्रह विधियों12 अधिक अनुमान लगा सकते है या17 वायरस की मात्रा को कम आंकना विवो खिला में के दौरान जमा, यह दर्शाता है कि इस तरह के डेटा सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । बहरहाल, इन विट्रो विधि अत्यधिक मूल्यवान है जब लार में वायरस की मात्र उपस्थिति के नजरिए से विश्लेषण किया, संचरण क्षमता का संकेत है ।
आर्बोवायरल रोग फैलने में मच्छर वैक्टर की भूमिका निर्धारित करने के लिए दो प्रमुख दृष्टिकोण मौजूद हैं। पहली विधि में क्षेत्र निगरानी शामिल है, जिसमें सक्रिय संचरण18, 19,20, 21, 22,23,24केसंदर्भ में मच्छरों को एकत्र कियाजाताहै। हालांकि, यह देखते हुए कि संक्रमण की दर आम तौर पर काफी कम होती है (उदाहरण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका में सक्रिय जीका वायरस (ZIKV) परिसंचरण के क्षेत्रों में मच्छरों की अनुमानित०.०६१%संक्रमण दर 21), संभावित वेक्टर प्रजातियों का अपराध पद्धति25,26 और यादृच्छिक मौका (उदाहरण के लिए, 1,600 असंक्रमितव्यक्ति से बाहर एक का नमूना लेने से भारी पक्षपाती हो सकता है) . इसे ध्यान में रखते हुए, दिए गए अध्ययन से संचरण में शामिल मच्छरों का सही नमूना लेने के लिए कच्चे नंबरों या प्रजातियों की विविधता दोनों में पर्याप्त मच्छर प्राप्त नहीं हो सकते हैं। इसके विपरीत, वेक्टर क्षमता विश्लेषण एक प्रयोगशाला सेटिंग में किए जाते हैं, जिससे मौखिक खुराक जैसे मापदंडों पर सख्त नियंत्रण की अनुमति होती है। हालांकि एक क्षेत्र की स्थापना में मच्छर संक्रमण और संचरण क्षमता की सही जटिलता का प्रतिनिधित्व करने में पूरी तरह से सक्षम नहीं है, ये प्रयोगशाला आकलन arbovirology के क्षेत्र में शक्तिशाली उपकरण बने हुए हैं।
मच्छरों की कई प्रजातियों, आबादी औरतरीकों27, 28, 29,30,31,32में ZIKV के साथ विभिन्न वेक्टर क्षमता विश्लेषण के आधारपर,साथ ही वेक्टर क्षमता आकलन की हाल ही में समीक्षा1,हम यहां एक विशिष्ट वेक्टर क्षमता कार्यप्रवाह से जुड़े कई प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन प्रयोगों में, अमेरिका (साल्वाडोर शहर) से तीन एई. एजिप्टी आबादी, ब्राजील; डोमिनिकन गणराज्य; और निचले रियो ग्रांडे वैली, TX, यूएसए) को कृत्रिम रक्तमेलों के माध्यम से 4, 5, या 6 लॉग10 फोकस-फॉर्मिंग यूनिट्स (FFU) /mL खुराक पर ZIKV (Mex 1-7, GenBank परिग्रहण: KX247632.1) के एक तनाव के संपर्क में थे । बाद में, विच्छेदन और सेल संस्कृति आधारित संक्रामक परख के माध्यम से बाह्य इनक्यूबेशन (2, 4, 7, 10 और 14 दिनों) के विभिन्न समयों के बाद संक्रमण, प्रसारित संक्रमण और संचरण क्षमता के सबूतों के लिए उनका विश्लेषण किया गया। यद्यपि वर्तमान वर्कफ्लो/प्रोटोकॉल ZIKV के लिए अनुकूलित हैं, कई तत्व सीधे आर्थ्रोपोड रोकथाम और जैवसंवाही स्तर 2 और 3 (एसीएल/बीएसएल2 या एसीएल/बीएसएल 3) में अन्य मच्छर जनित आर्बोवायरस में अनुवाद योग्य हैं।
यहां वर्णित विधियां वेक्टर क्षमता विश्लेषण करने के लिए एक सामान्यीकृत कार्यप्रवाह प्रदान करती हैं। एक सामान्य ढांचे के रूप में, इनमें से कई पद्धतियों को पूरे साहित्य में संरक्षित किया जाता है। हालां…
The authors have nothing to disclose.
हम उभरते वायरस और Arboviruses (WRCEVA) के लिए विश्व संदर्भ केंद्र के कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं: डॉ रॉबर्ट Tesh, हिल्डा Guzman, डॉ केनेथ Plante, डॉ जेसिका Plante, Dionna Scharton, और दिव्या Mirchandani, curating में अपने अथक काम के लिए और हमारे और अंय समूहों के वेक्टर दक्षता प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया वायरल उपभेदों के कई प्रदान करते हैं । प्रस्तुत काम McLaughlin फैलोशिप फंड (एसआरए) और NIH अनुदान AI120942 और AI121452 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |