JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Vector Kompetanse Analyser på Aedes aegypti Mygg ved hjelp av Zika Virus

Published: May 31, 2020
doi:
10.3791/61112
,
1Institute for Human Infections and Immunity,University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology,University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses,University of Texas Medical Branch

Summary

Den presenterte protokollen kan bestemme vektorkompetansen til Aedes aegypti myggpopulasjoner for et gitt virus, for eksempel Zika, i en inneslutningsinnstilling.

Abstract

Prosedyrene som presenteres beskriver en generalisert metodikk for å infisere Aedes aegypti mygg med Zika virus under laboratorieforhold for å bestemme infeksjonshastigheten, spre infeksjon og potensiell overføring av viruset i den aktuelle myggpopulasjonen. Disse prosedyrene er mye brukt med ulike modifikasjoner i vektorkompetanse evalueringer globalt. De er viktige for å bestemme den potensielle rollen som en gitt mygg (dvs. arter, befolkning, individ) kan spille i overføringen av et gitt middel.

Introduction

Vektorkompetanse er definert som evnen på nivået av arter, befolkning og til og med et individ, av en gitt leddyr som mygg, kryss eller phlebotomine sandflue, for å skaffe og overføre et middel biologisk med replikasjon eller utvikling i leddyr1,2. Med hensyn til mygg og leddyrbårne virus (dvs. arbovirus), er agenten imbibed fra en viremic vert av en kvinnelig mygg. Etter inntak må viruset produktivt infisere en av en liten populasjon av midgut epitelceller3, overvinne ulike fysiologiske hindringer som proteolytisk nedbrytning av fordøyelsesenzymer, tilstedeværelsen av mikrobiota (midgutinfeksjonsbarriere eller MIB), og den utskilte peritrofiske matrisen. Infeksjon av midgut epitelet må etterfølges av replikering av viruset og eventuell flukt fra midgut inn i myggens åpne sirkulasjonssystem, eller hemolymf, som representerer utbruddet av en spredt infeksjon som overvinne midgut escape barriere (MEB). På dette tidspunktet kan viruset etablere infeksjoner av sekundært vev (f.eks. nerver, muskler og fettlegemer) og fortsette å replikere, selv om slik sekundærreplikasjon kanskje ikke er strengt nødvendig for viruset å infisere acinarcellene i spyttkjertlene (overvinne spyttkjertelinfeksjonsbarrieren). Egress fra spyttkjertelen acinar celler inn i deres apikale hulrom og deretter bevegelse inn i spyttkanalen muliggjør inokulering av viruset i etterfølgende verter på biting, og fullfører overføringssyklusen1,2,4,5,6,7.

Gitt denne godt karakteriserte og generelt bevarte spredningsmekanismen i en myggvektor, er laboratorievektorkompetansevurderinger ofte metodisk like, selv om forskjeller i protokoller eksisterer1,2. Generelt, etter oral viruseksponering, blir mygg spredd slik at individuelle vev som midgut, ben, eggstokker eller spyttkjertler kan analysees for virusinfeksjon, spredt infeksjon, spredt infeksjon / potensiell transovarial overføring, og spredt infeksjon / potensiell overføringskompetanse, henholdsvis8. Bare tilstedeværelsen av et virus i spyttkjertlene er imidlertid ikke definitive bevis på overføringsevne, gitt bevis på en spyttkjertelflukt / utgående barriere (SGEB) i noen vektor / viruskombinasjoner1,2,4,5,7,9. Standardmetoden for å bevise overføringskompetanse forblir myggoverføring til et mottakelig dyr10,11,12. Men gitt at for mange arbovirus krever dette bruk av immunkompromitterte murinmodeller13,14,15,16, denne metoden er ofte kostnadsforbudende. Et vanlig brukt alternativ er samlingen av myggspytt, som kan analyseres ved omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) eller en smittsom analyse for å demonstrere tilstedeværelsen av henholdsvis viral genom eller smittsomme partikler. Det er verdt å merke seg at slike in vitro spytt innsamlingsmetoder kan overvurdere12 eller undervurdere17 mengden virus deponert under in vivo fôring, noe som indikerer at slike data må tolkes med forsiktighet. Likevel er in vitro-metoden svært verdifull når den analyseres fra perspektivet av bare tilstedeværelse av virus i spytt, noe som indikerer overføringspotensial.

To store tilnærminger eksisterer for å bestemme rollen som myggvektorer i arbovirale sykdomsutbrudd. Den første metoden innebærer feltovervåking, der mygg samles inn i sammenheng med aktiv overføring18,19,20,21,22,23,24. Men gitt at infeksjonsratene vanligvis er ganske lave (f.eks. den estimerte infeksjonsraten på 0,061% av mygg i områder med aktiv Zika-virus (ZIKV) sirkulasjon i USA21), kan inkriminering av potensielle vektorarter være sterkt partisk ved å fangemetodikk 25,26 og tilfeldig sjanse (f.eks. prøvetaking av et infisert individ av 1600 uinfiserte) . Med tanke på dette kan en gitt studie ikke skaffe tilstrekkelig mygg i både råtall eller artsmangfold for å nøyaktig prøve mygg involvert i overføring. Vektorkompetanseanalyser gjennomføres derimot i et laboratorium, noe som gir streng kontroll over parametere som oral dose. Selv om de ikke er fullt ut i stand til å representere den sanne kompleksiteten av mygginfeksjon og overføringsevne i et feltmiljø, forblir disse laboratorievurderingene kraftige verktøy innen arbovirologi.

Basert på ulike vektorkompetanseanalyser med ZIKV i flere myggarter, populasjoner og metoder27,28,29,30,31,32, samt en nylig gjennomgang av vektorkompetansevurderinger1, beskriver vi her flere av protokollene knyttet til en typisk vektorkompetansearbeidsflyt. I disse eksperimentene, tre Ae. aegypti befolkninger fra Amerika (byen Salvador, Brasil; Den dominikanske republikk; og den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) ble utsatt for en enkelt stamme av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) ved 4, 5 eller 6 logg10 fokusdannende enheter (FFU) / ml doser ved hjelp av kunstige blodmel. Deretter ble de analysert for bevis på infeksjon, formidlet infeksjon og overføringskompetanse etter ulike tider med ekstrinsisk inkubasjon (2, 4, 7, 10 og 14 dager) ved hjelp av formidling og en cellekulturbasert smittsom analyse. Selv om den nåværende arbeidsflyten / protokollene er optimalisert for ZIKV, er mange elementer direkte oversettbare til andre myggbårne arbovirus i leddyrblokkering og biosikkerhetsnivå 2 og 3 (ACL / BSL2 eller ACL / BSL3).

Protocol

Alle prosedyrer utført i disse protokollene ble utført i full overensstemmelse med protokoller godkjent av Institutional Biosafety Committee og Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Medical Branch ved Galveston. 1. Amplify ZIKV i Vero celler Vokse Vero celler (CCL-81 eller VeroE6) i Dulbecco modifikasjon av Eagle minimal essensielle medium (DMEM) supplert med 10% v / v varme-inaktivert foster bovine serum (FBS), og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (1…

Representative Results

Tre populasjoner av Ae. aegypti fra Amerika (Salvador, Brasil; Den dominikanske republikk; og Rio Grande Valley, TX, USA) ble utsatt for en utbruddsstamme av ZIKV fra Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) over en rekke blodmeltiter (4, 5 og 6 logg10 FFU / ml) presentert i en vasket menneskelig erytrocytbasert kunstig blodmel. På dag 2, 4, 7, 10 og 14 postinfeksjon ble undergrupper av mygg behandlet for å bestemme infeksjon, formidling og potensielle overføringshastigheter. <p clas…

Discussion

Metodene beskrevet her gir en generalisert arbeidsflyt for å gjennomføre vektorkompetanseanalyser. Som et generelt rammeverk er mange av disse metodene bevart gjennom hele litteraturen. Det er imidlertid betydelig rom for modifikasjoner (gjennomgått i Azar og Weaver1). Virus (f.eks. viral avstamning, lagring av utfordringsvirus, viral passasjehistorie), entomologi (f.eks. laboratoriekolonisering av myggpopulasjoner, medfødt immunitet, myggmikrobiomet/virom) og eksperimentelle variabler (f.eks….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkjenner staben til World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton og Divya Mirchandani, for deres utrettelige arbeid med å kuratere og gi mange av de virale stammene som brukes til våre og andre gruppers vektorkompetanseforsøk. Det presenterte arbeidet ble finansiert av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) og NIH gir AI120942 og AI121452.

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Here Are The Key Keywords From The Given Text: Vector CompetenceAedes AegyptiZika VirusArbovirusMosquitoesVector Competence AnalysesInfectious DiseasesVectorExperimentsInfected MosquitoesArthropod Containment FacilityBloodViral StockVero CellsInfectious Blood Meal
check_url/61112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image