JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

Published: May 31, 2020
doi:
10.3791/61112
,
1Institute for Human Infections and Immunity,University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology,University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses,University of Texas Medical Branch

Summary

Det presenterade protokollet kan bestämma vektorkompetensen hos Aedes aegypti myggpopulationer för ett visst virus, såsom Zika, i en inneslutningsmiljö.

Abstract

De förfaranden som presenteras beskriver en generaliserad metod för att infektera Aedes aegypti myggor med Zika virus under laboratorieförhållanden för att bestämma graden av infektion, spridad infektion och potentiell överföring av viruset i myggpopulationen i fråga. Dessa procedurer används i stor utsträckning med olika modifieringar i vektorkompetensutvärderingar globalt. De är viktiga för att bestämma den potentiella roll som en viss mygga (dvs. art, population, individ) kan spela vid överföring av ett visst medel.

Introduction

Vektorkompetens definieras som förmågan på art-, populations- och till och med en individs nivå hos en viss leddjur som mygga, fästing eller phlebotomine sandfluga, att förvärva och överföra ett medel biologiskt med replikering eller utveckling i leddjuret1,2. När det gäller myggor och leddjurburna virus (dvs. arbovirus) är medlet insuperat från en viremic värd av en kvinnlig mygga. Efter intag måste viruset produktivt infektera en av en liten population av midgut epitelceller3, övervinna olika fysiologiska hinder som proteolytisk nedbrytning av matsmältningsenzymer, närvaron av mikrobiota (midgut infektionsbarriären eller MIB) och den utsöndrade peritrofiska matrisen. Infektion av midgut epitel måste följas av replikering av viruset och eventuell flykt från midguten till myggans öppna cirkulationssystem, eller hemolymph, som representerar uppkomsten av en spridad infektion övervinna midgut escape barrier (MEB). Vid denna tidpunkt kan viruset fastställa infektioner i sekundära vävnader (t.ex. nerver, muskler och fettkroppar) och fortsätta att replikera, även om sådan sekundär replikering kanske inte är absolut nödvändig för att viruset ska infektera salivkörtlarnas acinära celler (övervinna salivkörtelinfektionsbarriären). Utgående från salivkörtelacincellerna i deras apikala håligheter och sedan rörelse i salivkanalen möjliggör inokulering av viruset till efterföljande värdar vid bitning och slutför överföringscykeln1,2,4,5,6,7.

Med tanke på denna väl karakteriserade och allmänt bevarade spridningsmekanism inom en myggvektor är laboratorievektorkompetensbedömningar ofta metodologiskt lika, även om skillnader i protokoll finns1,2. I allmänhet, efter oral virusexponering, dissekeras myggor så att enskilda vävnader som midgut, ben, äggstockar eller salivkörtlar kan analyseras för virusinfektion, spridad infektion, spridad infektion / potentiell transovariell överföring och spridad infektion / potentiell överföringskompetens, respektive8. Blotta förekomsten av ett virus i salivkörtlarna är dock inte definitiva bevis på överföringsförmåga, givet bevis på en salivary gland escape /egress barrier (SGEB) i vissa vektor/ viruskombinationer1,2,4,5,7,9. Standardmetoden för att bevisa överföringskompetens förblir myggöverföring till ett mottagligt djur10,11,12. Men med tanke på att för många arbovirus kräver detta användning av immunkomprometterade murinmodeller13,14,15,16, är denna metod ofta kostnadsöverkomlig. Ett vanligt alternativ är insamlingen av myggsaliv, som kan analyseras genom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) eller en infektiös analys för att visa närvaron av virusgenomet respektive infektiösa partiklar. Det är värt att notera att sådana in vitro-metoder för insamling av saliv kan överskatta12 eller underskatta17 mängden virus som deponeras under in vivo-utfodring, vilket indikerar att sådana uppgifter måste tolkas med försiktighet. In vitro-metoden är dock mycket värdefull när den analyseras ur perspektivet av blotta närvaron av virus i saliven, vilket indikerar överföringspotential.

Två viktiga metoder finns för att bestämma myggvektorernas roll vid utbrott av arboviralsjukdomar. Den första metoden innebär fältövervakning, där myggor samlas in i samband med aktiv överföring18,19,20,21,22,23,24. Med tanke på att infektionsfrekvensen vanligtvis är ganska låg (t.ex. den uppskattade 0,061% infektionshastigheten för myggor i områden med aktiv Zika-virus (ZIKV) cirkulation i USA21), kan inskrivning av potentiella vektorarter vara kraftigt partisk genom fångstmetod25,26 och slumpmässig slump (t.ex. provtagning av en infekterad individ av 1 600 oinfekterade)21 . Med hänsyn till detta får en viss studie inte förvärva tillräckligt med myggor i både råantal eller artmångfald för att noggrant prova myggor som är involverade i överföring. Däremot görs vektorkompetensanalyser i laboratoriemiljö, vilket möjliggör strikt kontroll av parametrar som oral dos. Även om de inte är fullt kapabla att representera den verkliga komplexiteten hos mygginfektion och överföringskapacitet i en fältmiljö, förblir dessa laboratoriebedömningar kraftfulla verktyg inom arbovirologi.

Baserat på olika vektorkompetensanalyser med ZIKV i flera myggarter, populationer och metoder27,28,29,30,31,32, samt en nyligen genomgång av vektorkompetensbedömningar1, beskriver vi här flera av protokollen i samband med ett typiskt vektorkompetensarbetsflöde. I dessa experiment utsattes tre Ae. aegypti populationer från Amerika (staden Salvador, Brasilien; Dominikanska republiken; och den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) för en enda stam av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) vid 4, 5 eller 6 log10 fokusbildande enheter (FFU) / ml doser genom konstgjorda blodmjöl. Därefter analyserades de för bevis på infektion, spridas infektion och överföring kompetens efter olika tider av extrinsic inkubation (2, 4, 7, 10 och 14 dagar) med hjälp av dissekering och en cell kultur-baserade infektiös analys. Även om det nuvarande arbetsflödet/protokollen är optimerade för ZIKV, kan många element direkt översättas till andra myggburna arbovirus i leddjursinneslutning och biosäkerhetsnivåer 2 och 3 (ACL/BSL2 eller ACL/BSL3).

Protocol

Alla procedurer som utfördes i dessa protokoll utfördes i full överensstämmelse med protokoll som godkänts av Institutional Biosafety Committee och Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Medical Branch i Galveston. 1. Förstärk ZIKV i Vero-celler Odla Vero-celler (CCL-81 eller VeroE6) i Dulbeccos modifiering av Eagles minimala essentiella medium (DMEM) kompletterat med 10% v/v värmeinaktiverat fetalt bovinserum (FBS), och 1% (v/v) penicillin-strept…

Representative Results

Tre populationer av Ae. aegypti från Amerika (Salvador, Brasilien; Dominikanska republiken; och Rio Grande Valley, TX, USA) utsattes för en utbrottsstam av ZIKV från Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) över en rad blodmjölstitrar (4, 5 och 6 log10 FFU/mL) presenterade i en tvättad mänsklig erytocyt. Vid dag 2, 4, 7, 10 och 14 postinfection bearbetades undergrupper av myggor för att bestämma infektion, spridning och potentiella överföringshastigheter. <p class="jove_conte…

Discussion

Metoderna som beskrivs här ger ett generaliserat arbetsflöde för att genomföra vektorkompetensanalyser. Som en allmän ram bevaras många av dessa metoder i hela litteraturen. Det finns dock stort utrymme för ändringar (granskas i Azar och Weaver1). Virus (t.ex. virus härstamning, lagring av utmaningsvirus, viral passagehistoria), entomologi (t.ex. laboratoriekolonisering av myggpopulationer, medfödd immunitet, myggmikrobiom/virom) och experimentella variabler (t.ex. blodmjölssammansättn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi bekräftar personalen vid World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton och Divya Mirchandani, för deras outtröttliga arbete med att kurera och tillhandahålla många av de virusstammar som används för våra och andra gruppers vektorkompetensexperiment. Det presenterade arbetet finansierades av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) och NIH-bidrag ai120942 och AI121452.

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Here Are The Key Keywords From The Given Text: Vector CompetenceAedes AegyptiZika VirusArbovirusMosquitoesVector Competence AnalysesInfectious DiseasesVectorExperimentsInfected MosquitoesArthropod Containment FacilityBloodViral StockVero CellsInfectious Blood Meal
check_url/61112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image