نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران
Summary
يمكن أن تركز الموجات فوق الصوتية مع وكلاء microbubble فتح حاجز الدم في الدماغ بشكل مركز وعابر. وقد استخدمت هذه التقنية لتقديم مجموعة واسعة من العوامل عبر حاجز الدم في الدماغ. توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل للتسليم المترجمة إلى الدماغ القوارض مع أو بدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي.
Abstract
جراحة تكسيف هو المعيار الذهبي للمخدرات المحلية وتسليم الجينات إلى الدماغ القوارض. هذه التقنية لديها العديد من المزايا على التسليم النظامي بما في ذلك التعريب الدقيق إلى منطقة الدماغ المستهدفة والحد من الآثار الجانبية الهدف. ومع ذلك، فإن جراحة تكسينية مجسمة هي شديدة التوغل مما يحد من فعاليتها الترجمية، وتتطلب أوقات تعافي طويلة، وتوفر تحديات عند استهداف مناطق متعددة في الدماغ. يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) بالاقتران مع الزبقات الدقيقة المتداولة لفتح حاجز الدم في الدماغ (BBB) في مناطق بحجم ملليمتر. يسمح هذا التعريب داخل الجمجمة من العوامل التي يتم تسليمها بشكل نظامي التي لا يمكن عادة عبور BBB. توفر هذه التقنية بديلاً غير جراحي للجراحة اجسارية. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع في مختبرات علم الأعصاب بسبب محدودية الوصول إلى المعدات والطرق الموحدة. والهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير نهج سطح المقعد لفتح FUS BBB (BBBO) بأسعار معقولة وقابلة للتكرار، وبالتالي يمكن اعتماده بسهولة من قبل أي مختبر.
Introduction
على الرغم من الاكتشافات العديدة في علم الأعصاب الأساسية، فإن عدد العلاجات الناشئة لاضطرابات النمو العصبي والاعصاب لا تزال محدودة نسبيا1،2. وقد اقترح فهم أعمق للجينات والجزيئات والدوائر الخلوية المشاركة في الاضطرابات العصبية العلاجات الواعدة التي لا يمكن إدراكها في البشر مع التقنيات الحالية3. غالباً ما تكون محدودة العلاجات الفعالة من قبل الحاجة إلى أن تكون penetrable الدماغ وموقع محدد4,5,6,7,8. ومع ذلك، فإن الطرق الحالية لتوصيل المخدرات المحلية إلى مناطق معينة من الدماغ (على سبيل المثال، الولادة عن طريق الحقن أو القنية) هي طرق غازية وتتطلب فتحًا في الجمجمة9. يمنع غزو هذه الجراحة الاستخدام الروتيني للتسليم الموضعي في الدماغ البشري. بالإضافة إلى ذلك ، تلف الأنسجة والاستجابات الالتهابية الناتجة هي الخلطات في كل مكان للدراسات الأساسية وما قبل الإكلينيكية التي تعتمد على الحقن داخل الدماغ10. القدرة على تسليم وكلاء nonininsiveively عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) واستهدافهم إلى مناطق محددة في الدماغ يمكن أن يكون لها تأثير هائل على علاجات الاضطرابات العصبية، في حين توفير في الوقت نفسه أداة تحقيق قوية للبحوث قبل الإكلينيكية.
طريقة واحدة من وسائل النقل المستهدفة عبر BBB مع الحد الأدنى من الضرر الأنسجة هو الموجات فوق الصوتية التركيز transcranial (فوس) جنبا إلى جنب مع microbubbles لفتح محوري وعابر BBB11،12،13،14،15،16. وقد اكتسب فتح FUS BBB الاهتمام الأخير لعلاج الاضطرابات العصبية ، السكتة الدماغية و الدبقية عن طريق توطين العلاجات لاستهداف مناطق الدماغ مثل العوامل العصبية17,18,19, العلاجات الجينية20,21,22, الأجسام المضادة23, الناقلات العصبية24, و الجسيمات النانوية25,26,27,28,29. مع مجموعة واسعة من التطبيقات وطبيعتها غير الباضعة30,31, فتح FUS BBB هو بديل مثالي للحقن التريو كسيائي داخل الجمجمة. وعلاوة على ذلك، نظرا لاستخدامها حاليا في البشر30،32، يمكن اعتبار التحقيقات قبل الظهر باستخدام هذه التقنية الترجمية للغاية. ومع ذلك ، FUS BBB فتح لم يتم بعد تقنية راسخة على نطاق واسع في العلوم الأساسية والبحوث قبل الكلينيكية بسبب عدم وجود إمكانية الوصول. لذلك، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنهج benchtop لفتح FUS BBB كنقطة انطلاق للمختبرات المهتمة في تأسيس هذه التقنية.
وقد أجريت هذه الدراسات مع إما الهواء عالية الطاقة المدعومة FUS محول الموجات فوق الصوتية محددة أو انخفاض الطاقة تخمد ركزت محول الغمر بالموجات فوق الصوتية. وكانت محولات مدفوعة من قبل مكبر للصوت RF السلطة مصممة للأحمال التفاعلية ومولد وظيفة benchtop القياسية. يمكن العثور على تفاصيل هذه العناصر في جدول المواد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا نهج benchtop لmicrobubble ساعد FUS BBB فتح مع نهج بديلة بما في ذلك، اثنين من محولات مختلفة وأساليب لاستهداف داخل الجمجمة مع وبدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي. حاليا، من أجل إنشاء التصوير بالرنين المغناطيسي الموجهة FUS BBB فتح في المختبر، وهناك خيار لشراء ممتازة جاهزة للاستخدام الأجهزة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل منحة البنية التحتية للبحوث EPSCoR NSF لجامعة كليمسون (1632881). بالإضافة إلى ذلك، تم دعم هذا البحث جزئيًا من قبل مركز سيفيتان الدولي للأبحاث، برمنغهام، AL. الكتاب الاعتراف بامتنان استخدام الخدمات والمرافق من جامعة ألاباما في برمنغهام الصغيرة الحيوانات تصوير مرفق منحة المشتركة [المعاهد الوطنية للصحة P30 CA013148]. ويعترف أصحاب البلاغ راجيف شوبرا بدعمه وتوجيهه.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson’s disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -. Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson’s disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson’s disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -. H., Lin, C. -. Y., Liu, H. -. L., Yeh, C. -. K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -. H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -. T., Wei, K. -. C., Liu, H. -. L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- . Compound Administration I Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020)
- Liu, H. -. L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O’Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
