Summary
Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.
Abstract
Cirurgia estereotaxica é o padrão ouro para a droga localizada e a entrega de genes para o cérebro de roedores. Essa técnica tem muitas vantagens sobre a entrega sistêmica, incluindo localização precisa para uma região cerebral alvo e redução de efeitos colaterais fora do alvo. No entanto, a cirurgia estereotaxa é altamente invasiva, o que limita sua eficácia translacional, requer longos tempos de recuperação e oferece desafios ao atingir múltiplas regiões cerebrais. O ultrassom focado (FUS) pode ser usado em combinação com microbolhas circulantes para abrir transitoriamente a barreira cerebral do sangue (BBB) em regiões de tamanho milímetro. Isso permite a localização intracraniana de agentes entregues sistematicamente que normalmente não conseguem atravessar o BBB. Esta técnica fornece uma alternativa não invasiva à cirurgia estereotaxa. No entanto, até o momento, essa técnica ainda não foi amplamente adotada em laboratórios de neurociência devido ao acesso limitado a equipamentos e métodos padronizados. O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB (BBBO) que seja acessível e reproduzível e, portanto, possa ser facilmente adotada por qualquer laboratório.
Introduction
Apesar das muitas descobertas na neurociência básica, o número de tratamentos emergentes para distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos permanece relativamente limitado1,2. Uma compreensão mais profunda dos genes, moléculas e circuitos celulares envolvidos em distúrbios neurológicos tem sugerido tratamentos promissores irrealizáveis em humanos com técnicas atuais3. Tratamentos eficazes são muitas vezes limitados pela necessidade de ser penetrável cerebral e específico do local4,5,6,7,8. No entanto, os métodos existentes de entrega de medicamentos localizados para regiões cerebrais específicas (por exemplo, entrega via injeção ou cânula) são invasivos e requerem uma abertura a ser feita no crânio9. A invasividade desta cirurgia impede o uso rotineiro do parto localizado no cérebro humano. Além disso, os danos teciduais e as respostas inflamatórias resultantes são confundimentos onipresentes para estudos básicos e pré-clínicos que dependem da injeção intracerebral10. A capacidade de fornecer agentes não invasivamente através da barreira cerebral sanguínea (BBB) e direcioná-los para regiões cerebrais específicas pode ter um tremendo impacto nos tratamentos para distúrbios neurológicos, ao mesmo tempo em que fornece uma poderosa ferramenta investigativa para pesquisas pré-clínicas.
Um método de transporte direcionado através do BBB com dano mínimo de tecido é o ultrassom focado transcranário (ME) juntamente com microbolhas para abrir o BBB11,12,13,14,15,16. A abertura do FUS BBB ganhou atenção recente para o tratamento de distúrbios neurodegenerativas, derrame e glioma, localizando terapêuticas para atingir regiões cerebrais como fatores neurotróficos17,18,19, terapias genéticas20,21,22, anticorpos23, neurotransmissores24, e nanopartículas25,26,27,28,29. Com sua ampla gama de aplicações e sua natureza não invasiva30,31, a abertura do FUS BBB é uma alternativa ideal para injeções intracranianas estereotaxas rotineiras. Além disso, devido ao seu uso atual em humanos30,32, investigações pré-clínicas usando essa técnica podem ser consideradas altamente translacionais. No entanto, a abertura do FUS BBB ainda não foi uma técnica amplamente estabelecida em ciência básica e pesquisa pré-científica devido à falta de acessibilidade. Por isso, fornecemos um protocolo detalhado para uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB como ponto de partida para laboratórios interessados em estabelecer essa técnica.
Estes estudos foram conduzidos com um transdutor de ultrassom específico de ar apoiado por ar de alta potência ou um transdutor de imersão ultrassônica de baixa potência. Os transdutores foram conduzidos por um amplificador de energia RF projetado para cargas reativas e um gerador de função de bancada padrão. Os detalhes para esses itens podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da UAB.
1. Configuração focada do equipamento de condução de ultrassom
- Utilize 50 cabos BNC coaxiais Ohm para conectar (1) a entrada do transdutor de ultrassom à saída do amplificador RF e (2) a entrada do amplificador RF à saída do gerador de função.
- Ajuste o modo gerador de função para uma rajada sinusoide uma vez por segundo com um ciclo de 1% de serviço.
- Para o transdutor de imersão de baixa potência de 1 MHz úmido com uma distância focal de 0,8 polegadas usada com um amplificador RF de 50 dB, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1 MHz, pico de 1 V ao pico, ciclo de 10k, intervalo de 1 s (ou período).
- Para o ar apoiado, transdutor de alta potência de 1,1 MHz, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1,1 MHz, pico de 50 mV ao pico, ciclos de 11k, intervalo de 1 s.
NOTA: Não opere os transdutores a menos que estejam submersos. Não coloque uma mão ou outra parte do corpo no foco do ultrassom ou toque na face do transdutor enquanto estiver em funcionamento.
2. Configuração focada no bancada de ultrassom
- Imprima em 3D o quadro estereotício e o porta-quadros estereotáticos.
- Conecte o transdutor ao posicionador XYZ usando um grampo segurando um tubo de PVC(Figura 1a). Aperte o grampo no deslizamento do eixo X e bloqueie com uma porca de asa.
- Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, conecte-o ao tubo de PVC usando um par de ímãs combinados. Certifique-se de que um ímã tem um orifício e o outro tem uma saliência correspondente. Tampe a parte inferior do tubo de PVC e conecte um dos ímãs a ele usando epóxi (ver Figura 1b).
- Conecte o segundo ímã ao centro superior do transdutor de ultrassom de alta potência usando epóxi. Certifique-se de que está no centro do transdutor (Figura 1c).
- Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, faça um ponteiro para anular o posicionador XYZ. A ponta deste ponteiro indica a localização no espaço do centro do foco do transdutor quando o transdutor de ultrassom estiver ligado ao posicionador XYZ. Faça um ponteiro de uma agulha de 18 G cortada para ser o comprimento da distância focal do transdutor mais a espessura do transdutor(Figura 1d).
- Aplique epóxi em um terceiro ímã (este ímã também emparelha com o ímã da tampa de PVC) e conecte-o à parte superior do ponteiro. Em seguida, o ponteiro poderá ser anexado ao ímã no tubo de PVC para nulidade XYZ(Figura 1d).
- Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, imprima em 3D o arquivo para o ponteiro e o clipe de montagem.
- Conecte o transdutor de imersão de baixa potência ao tubo de PVC, cortando o clipe de montagem no tubo de PVC e inserindo o transdutor no anel(Figura 1f).
- Faça um banho de água colando peças cortadas da folha de acrílico que poderão descansar em cima da cabeça do animal acima do quadro estereotático(Figura 1e).
- Corte uma abertura no fundo do banho que é do tamanho da cabeça do animal. Cubra o buraco no banho de água com uma fita de poliimida.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a água não vaze ao redor da fita de poliimida, pois pode molhar a pele do rato e causar hipotermia.
- Corte uma abertura no fundo do banho que é do tamanho da cabeça do animal. Cubra o buraco no banho de água com uma fita de poliimida.
- Faça uma ressonância magnética fiducial preenchendo uma esfera de plástico ou vidro de 4 mm de diâmetro com um fluido visível de ressonância magnética (por exemplo, óleo de vitamina E) e selá-lo. Coloque-o no suporte fiducial de ressonância magnética no lado direito do quadro estereotítico impresso em 3D(Figura 2a).
- Fixar firmemente o suporte de quadro impresso em 3D ao posicionador XYZ em um bom local para posicionamento animal. Deslize a guia na extremidade rostral do suporte do quadro para o canal correspondente no trilho do eixo Y e fixando com parafusos definidos(Figura 1h, setas vermelhas).
- Para dirigir o posicionador XYZ, instale o conversor USB para serial em um computador seguindo as instruções do fabricante e conecte o conversor. Instale o ambiente de tempo de execução e o software do controlador do motor no PC.
- Certifique-se de que a porta serial adequada seja selecionada no software selecionando o CONVERSOR USB para serial no controle de dropdown de seleção da porta no painel frontal do software do controlador. Conecte o USB ao conversor serial à caixa do controlador do motor do estepe usando um cabo crossover serial de 9 pinos (por exemplo, cabo de modem nulo RS232).
- Execute o software do controlador para testar que os motores do stepper podem ser acionados sob controle de software. Esta etapa pode exigir a assistência do suporte local de TI.
3. Procedimento de segmentação intracraniana
NOTA: Ratos machos Sprague Dawley pesando 250-350 g foram usados para esses experimentos. Os animais tinham livre acesso à água e à comida de rato, e eram mantidos em um ciclo claro: escuro de 12:12 h.
- Coloque o animal sob anestesia (3% isoflurane com oxigênio) e verifique se há falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo. Em seguida, insira o cateter conforme descrito abaixo.
- Aqueça a cauda com uma lâmpada para fazer é mais fácil de acertar a veia. Tenha cuidado para não superaquecer o animal ou queimar a cauda.
- Uma vez que o animal esteja dormindo (não responde a uma pitada de dedo do dedo do dedo), insira o cateter da veia da cauda de 24 G que será usado para entregar microbolhas, corante azul Evans (EBD), contraste de ressonância magnética gadobutrol se usar ressonância magnética, e o agente experimental de interesse. Uma vez que a veia é atingida, o sangue encherá a bainha, lentamente removerá a agulha interna enquanto empurra a bainha mais para dentro da veia.
NOTA: Veja um guia como Stuart e Schroeder33 se fizerem as injeções da veia da cauda do rato pela primeira vez. - Se não houver fluxo sanguíneo, mova lentamente a bainha do cateter para fora da veia para testar que a agulha pode ter cutucado através da veia. Se o sangue fluir quando o cateter é puxado para trás ligeiramente, então primeiro poke atravessou a veia e a colocação do cateter precisará ser reiniciada em outro local na cauda que é rostral para o local anterior.
- Encha o plugue do cateter com soro fisiológico e enrosque o cateter plugue na extremidade da porta do cateter assim que a porta estiver cheia de sangue. Enrole cuidadosamente a fita de laboratório ao redor do cateter e da cauda para mantê-lo no lugar. Comece com uma pequena peça na parte superior e trabalhe na direção caudal, deixando a extremidade do plugue do cateter exposta.
- Conecte a linha de anestesia no conector da anestesia no quadro estereotaxico(Figura 2a)e fixe a cabeça dos animais na moldura, colocando a boca na barra de mordida e guiando as barras de ouvido em ambos os canais auditivos, em seguida, aperte os parafusos do conjunto. Certifique-se de que a cabeça dos animais está segura e nivelada.
- Mova o animal para o leito de ressonância magnética e conecte a linha de anestesia ao cone do nariz. Neste protocolo foi utilizada uma ressonância magnética animal de 9,4 T.
- Coletar imagens coronárias e axiais de peso T2 que capturam todo o cérebro, bem como o fiduciário de ressonância magnética(Figura 2b) para medições coordenadas. Forneça ao físico ou técnico de ressonância magnética local as seguintes informações para que eles possam construir o protocolo de ressonância magnética.
- Para imagens coronais (Figura 2b superior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 27, largura: 62,2 mm, altura: 62,2 mm, profundidade: 37,97 mm, tamanho Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Para imagens axiais(Figura 2b inferior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 13, Largura: 61,47 mm, Altura: 53,81 mm, Profundidade: 16,7 mm, tamanho Voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
NOTA: Não é necessário ter esses parâmetros exatos, desde que o coronal em resolução do plano esteja perto de 0,25 mm e as imagens cubram todo o cérebro e fiduciário.
- Colete medições coordenadas das imagens acima registrando a distância do fiducial de ressonância magnética até a região cerebral que será alvo de FUS.
- No scanner, nas imagens coronais coletadas na etapa 3.5, encontram-se a imagem em que o fiducial é o maior, indicando o centro do fiduciário. Regisso o ponto de distância do topo do fiduciário até a região do cérebro de interesse em mm (o software de ressonância magnética terá uma ferramenta de medição de escala ou ponto, consulte a tecnologia ou físico local de ressonância magnética sobre como fazer isso) tanto na direção medial/lateral quanto na direção ventral dorsal(Figura 2b, topo).
- No scanner, nas imagens axiais coletadas na etapa 3.5, encontre a imagem que mostra a parte superior do fiduciário e meça a distância do centro do fiducial até a região cerebral alvo tanto na direção dorsal/ventral quanto na direção medial/lateral(Figura 2b, inferior).
- Compare as duas medidas medial/lateral e se forem diferentes use a média. Estas medidas coordenadas serão usadas mais tarde na etapa 4.3 para guiar o ponto focal do FUS para a região cerebral alvo com o posicionador XYZ.
- Colete imagens de ressonância magnética. Compare essas imagens com as imagens coletadas após a abertura do FUS BBB (Figura 4). Imagens ponderadas com T1 serão usadas posteriormente para visualizar a abertura do BBB, imagens ponderadas com T2 serão posteriormente usadas para garantir que nenhum dano tecidual tenha ocorrido após o tratamento de FUS34.
- Para imagens axiais ponderadas em T1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 3,0 mm, tamanho do voxel: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, número de imagens: 13.
- Para imagens axiais ponderadas por T2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 2,6 mm, tamanho do voxel: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, número de imagens: 13.
- Para imagens coronais ponderadas t1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, número de imagens: 27.
- Para imagens coronais ponderadas t2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, número de imagens: 27.
NOTA: Como na etapa 3.5, esses parâmetros de imagem não precisam ser exatamente os mesmos listados. Essas imagens têm um FOV menor e resolução maior do que as coletadas na etapa 3.5.
- Mantendo o animal na estrutura estereotaxa, transporte rapidamente o animal do leito de ressonância magnética até a configuração do FUS do topo do banco. Certifique-se de que o animal permaneça dormindo para a transferência sob o efeito da anestesia.
- Para tempos de transferência mais longos, use uma caixa para transferência que seja grande o suficiente para caber no animal e no quadro. Com o plugue de anestesia ainda ligado, coloque o animal e o quadro dentro da caixa e deixe o excesso de isoflurane encher a caixa por alguns minutos. Desligue a linha de anestesia e transfira rapidamente.
4. Procedimento de ultrassom focado
- Ao chegar à configuração do banco fus, conecte imediatamente a linha de anestesia no cone do nariz e continue a correr 1,5-3% de isoflurano com oxigênio. Faça isso o mais rápido possível para evitar que o animal acorde.
- Deslize o quadro para o suporte da armação e encaixe-o firmemente. Use cortadores para raspar a cabeça do animal. Escove o excesso de cabelo e aplique creme de removedor de cabelo no couro cabeludo. Deixe descansar por 3 minutos e limpe com água e gaze.
- Se a ressonância magnética não estiver disponível para segmentação, use um quadro estereotático padrão (não impresso em 3D) para anular a posição do ponteiro para bregma tocando na ponta do ponteiro para bregma (uma incisão do couro cabeludo será necessária para isso) e anulando o software ou gravando as coordenadas. Mova a carruagem XYZ em 50 mm clicando no botão up 50 no software e trocando o ponteiro pelo transdutor. Com base em um atlas cerebral de rato como descrito anteriormente35, mova-se para as coordenadas cerebrais desejadas usando os botões de pisação no software. Se usar este método em vez de ressonância magnética, pule para a seção 4.6.
- Se utilizar orientação de ressonância magnética, conecte o ponteiro e mova o ponteiro para a localização do fiducial de ressonância magnética(Figura 1d,g). Posicione o ponteiro na parte superior e central do fiducial de ressonância magnética (é fornecido um pequeno orifício na parte superior do suporte fiducial para apontar). Clique no botão de posição nula que é o ponto a partir do qual todas as distâncias na imagem de ressonância magnética foram calculadas.
- Remova o ponteiro e mova o posicionador para as coordenadas medial/lateral e as coordenadas rostral/caudal. Levante o posicionador pressionando o botão até 50 para permitir a colocação do banho de água e do gel de ultrassom. Se a parte superior da viagem do eixo Z for atingida, o local de anulação será invalidado. A coordenada dorsal/ventral será definida após a adição do transdutor.
- Aplique gel de ultrassom no couro cabeludo do animal e coloque o banho de água sobre o animal com a janela de fita poliimida pressionada sobre o gel. Certifique-se de que não há bolhas de ar no gel de ultrassom.
- Encha o banho de água com água desgaseada.
- Se usar o transdutor de alta potência, baixe o posicionador para que o ímã fique logo acima da água. Conecte o transdutor ao posicionador baixando cuidadosamente o transdutor na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto e conectem os ímãs.
- Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, baixe o posicionador na água logo acima do clipe do transdutor. Em seguida, corte o transdutor no lugar, baixando-o lentamente na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto.
NOTA: Um banho transparente é útil ao olhar sob a face do transdutor para bolhas. - Abaixe o posicionador para a coordenada dorsal/ventral.
- Ligue o amplificador de energia RF.
- Injete 1 mL/kg de corante azul Evans (EBD) colocando a ponta da agulha no plugue do cateter e injetando. Deixe circular por 5 minutos.
- Ative os microbolhas sacudindo-os violentamente com o agitador de bolhas.
- Prepare 5x a dose de 30 μL/kg de microbolhas (bolha conc. 1,2 x 1010/mL) em 0,2 mL de soro fisiológico para explicar os 2 tratamentos de FUS e a tubulação no conjunto de infusão alado 18 G. Por exemplo, se o rato pesa 200 g, então encha a seringa contendo ponta de agulha de 18 G com 30 μL de microbolhas em 1 mL de soro fisiológico.
NOTA: Certifique-se de usar pontas de agulha de 18 G para até pegar e injetar com o conjunto de infusão alado. - Inverta a seringa várias vezes para obter uma distribuição uniforme de microbolhas. Em seguida, anexe e encha o conjunto de infusão alado. Posicione a seringa na bomba de infusão e ajuste a bomba de infusão para entregar 0,2 mL a uma taxa de 6 mL/h. Isso fornecerá uma infusão lenta dos microbolhas sobre a exposição de FUS de 2 minutos.
- Insira a agulha alada no plugue do cateter.
- Prepare 5x a dose de 30 μL/kg de microbolhas (bolha conc. 1,2 x 1010/mL) em 0,2 mL de soro fisiológico para explicar os 2 tratamentos de FUS e a tubulação no conjunto de infusão alado 18 G. Por exemplo, se o rato pesa 200 g, então encha a seringa contendo ponta de agulha de 18 G com 30 μL de microbolhas em 1 mL de soro fisiológico.
- Primeiro, execute a bomba de infusão, espere 3 s e inicie o tratamento de FUS pressionando o botão de habilitação de saída no gerador de função (rotulado "nogerador de função na Tabela de Materiais). Repita essas duas vezes por região com 5 minutos entre elas para permitir que as microbolhas se limpem.
- Pressione o botão on novamente no gerador de função para parar o tratamento de FUS quando a bomba de infusão parar em 2 min.
- Espere 5 min para as microbolhas limparem. Em seguida, inicie a infusão e o segundo tratamento de FUS.
- Imediatamente após o segundo tratamento de FUS, injete contraste de gadobutrol (se estiver usando ressonância magnética) e o agente de interesse, por exemplo, partículas virais. O volume total entregue de todos os agentes não deve exceder 5 mL/kg.
NOTA: O tempo de entrega (por exemplo, antes ou depois da abertura do FUS BBB) do agente de interesse pode diferir dependendo do agente utilizado.
- Desligue o amplificador de energia RF e transporte imediatamente o animal de volta para a ressonância magnética.
5. Confirmação de ressonância magnética da abertura do BBB
- Se a ressonância magnética não estiver disponível, pule para a seção 6 e use a expressão EBD para confirmação da abertura do BBB.
- Coloque o animal de volta no leito de ressonância magnética exatamente no mesmo local que na etapa 3.7 e conecte a linha de anestesia.
- Colete os postes de ressonância magnética com os mesmos parâmetros de imagem utilizados na etapa 3.7 para visualizar o aprimoramento da ressonância magnética gadobutrol na região de abertura do BBB (Figura 3b,e).
6. Perfusão e coleta de tecidos
- Perfunda o animal com formalina fria de 4% até que o sangue se esclae completamente.
- Remova o cérebro e coloque em 4% de formalina ou PFA a 4 °C durante a noite. Em seguida, coloque o cérebro em 30% de solução de sacarose até que o cérebro afunde (cerca de 2-3 dias). Finalmente, o flash congele em nitrogênio líquido ou em gelo seco e armazene a -80°C até que se cryosectioning.
- Congele o cérebro em OUTUBRO e faça criosections.
- Corrigir e cobrir seções de deslizamento para microscopia de fluorescência. A excitação do EBD atinge picos de excitação de 470 e 540 nm e picos de emissões a 680 nm. Tampar com meio de montagem DAPI para visualizar morfologia celular global.
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Representative Results
Aqui, demonstramos que o ultrassom focado com microbolhas pode induzir abertura de BBB localizada utilizando os parâmetros especificados acima com o transdutor de imersão de baixa potência(Figura 3) e o transdutor FUS(Figura 4). Primeiro, em experimentos iniciais, o transdutor de imersão de baixa potência foi direcionado para um hemisfério cerebral anterior(Figura 3b) ou medial(Figura 3a). Os animais foram então sacrificados 2 horas depois com perfusão (Figura 3a) ou sem perfusão(Figura 3b) e 10 μm de seções cerebrais congeladas foram coletadas. A abertura do FUS BBB ficou evidente pela autofluorescência EBD (excitação: 470 e 540 nm, emissão: 680 nm) no hemisfério alvo (setas brancas Figura 3a a e 3b).
Achamos melhor perfumar os animais para visualização clara da abertura do BBB com autofluorescência EBD. No entanto, a abertura do BBB ainda pode ser visualizada sem limpar os vasos sanguíneos (Figura 3b). Captação celular e liberação de EBD após a abertura do BBB começa logo após a abertura do BBB e aumenta mais de 24 horas37. Para avaliação da abertura do BBB com autofluorescência EBD, é melhor sacrificar o animal entre 15 minutos e 3 horas de abertura do BBB. Embora, em última análise, o tempo de sacrifício dependerá do agente que foi entregue. Por exemplo, em um estudo AAV, 3 semanas após a abertura do BBB e entrega de AAV(Figura 5c) podem ser apropriadas.
Em experimentos posteriores, o transdutor fus foi direcionado tanto para o hipocampo (Figura 4a-c) ou para o córtex cingulado anterior (ACC) (Figura 4 d-f) e, além do EBD, o agente de contraste de ressonância magnética gadobutrol (0,1 mL/kg) foi iv injetado para verificar a abertura direcionada do BBB in vivo. Figura 4b,e mostrar contraste aprimorado de ressonância magnética onde o contraste de gadobutrol entrou no tecido 1 hora após a abertura do BBB e injeção de agente de contraste. Essa mudança de contraste é evidente quando comparada com os prescans de ressonância magnética tomados antes do procedimento de FUS(Figura 4a,d). Os animais foram então sacrificados por perfusão 1,5 horas após a abertura do BBB e 10 μm criosections foram coletados. A autofluorescência EBD é evidente em regiões alvo de FUS indicando ainda mais a localização da abertura do BBB (Figura 4c,f). Esta figura destaca como o contraste da ressonância magnética pode às vezes ser difícil de ver (como na diferença entre a Figura 4b e a Figura 4e); portanto, é útil confirmar a abertura do BBB com visualização de autofluorescência EBD como no micrografo de fluorescência na Figura 4f.
Para avaliar se essa técnica poderia ser usada para a entrega genética direcionada AAV9-hsyn-GFP e contraste gadobutrol foram injetados IV (titer: 1,32 x 1014 GC/mL, 0,05 mL/kg) imediatamente após a abertura do BBB no hipocampo. O animal foi então MR imaged 30 minutos após a abertura do BBB e sacrificado 3 semanas depois por perfusão. Foram coletadas 10 crioseções de μm para imagem fluorescente da expressão GFP. A abertura do BBB ficou evidente pelo contraste de gadobutrol no hipocampo alvo (Figura 5a,b). Além disso, a entrega de genes foi confirmada pela expressão GFP no hipocampo alvo evidente pela fluorescência verde (Figura 5c). Observe que neste momento o EBD foi eliminado e só é evidente nos ventrículos(Figura 5c).
Figura 1: Configuração do bancada de FUS. (a) Configuração de FUS, incluindo o posicionador XYZ, um tubo de PVC de 30 mm de diâmetro para fixação do transdutor, o quadro estereotaxic impresso em 3D e a bomba de infusão. (b) A extremidade do tubo de PVC é tampada, e um ímã é anexado a ele com epóxi. (c) Outro ímã correspondente é anexado ao centro superior do transdutor de alta potência com epóxi. (d) Além disso, outro ímã correspondente é anexado ao ponteiro para anular o posicionador na parte superior e central do fiducial de ressonância magnética. (e) O ponteiro é eventualmente substituído pelo transdutor de alta potência e um banho de água é acoplado à cabeça do animal com gel de ultrassom. fO transdutor de imersão de baixa potência pode ser anexado ao tubo de PVC com o clipe transdutor impresso em 3D. (g) Para o posicionamento, o transdutor é substituído pelo ponteiro impresso em 3D e o posicionador é nulo na parte superior e central do fiduciário de ressonância magnética. (h) O porta-quadros impresso em 3D estacionário permite que o animal seja devolvido à mesma posição após a ressonância magnética se forem necessários vários tratamentos de FUS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quadro estereotaxico com fiducial de ressonância magnética para coordenadas guiadas por ressonância magnética. (a) Os animais são posicionados pela primeira vez em um quadro estereutário impresso em 3D equipado com um fiducial de ressonância magnética. (b) O quadro é então colocado dentro do leito de ressonância magnética e a distância do círculo fiduciário (pontilhado) para a região cerebral alvo é medida utilizando-se tanto imagens coronais para as medidas dorsais/ventral (D/V) quanto imagens axiais para as medidas rostral/caudal (R/C), a medição medial/lateral (M/L) pode ser coletada de ambos os eixos. Os animais são mantidos na estrutura e transferidos para a estação FUS onde um ponteiro é usado para anular o posicionador XYZ na localização do fiduciário. O ponteiro é então substituído pelo transdutor e que pode então ser movido com base nas coordenadas coletadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O corante azul evans (EBD) confirma que fus BBB abre com e sem perfusão. (a) Micrografia de uma seção cerebral de 10 μm 2 horas após a abertura do FUS BBB com o transdutor de imersão de baixa potência direcionado ao hemisfério esquerdo medial. Esta é uma imagem representativa de um animal que foi perfundido com 4% de formalina tamponada antes da coleta de tecidos. A abertura do BBB é evidente pela autofluorescência vermelha EBD (seta). (b) Micrografia de uma seção cerebral de 10 μm 2 horas após a abertura do FUS BBB direcionada para o hemisfério esquerdo anterior. Esta é uma imagem representativa de um animal que não foi perfundido antes da coleta de tecidos, portanto, eBD permanece nos vasos sanguíneos. A abertura do BBB é evidente onde o EBD vazou dos vasos sanguíneos (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Abertura do FUS BBB confirmada com contraste de Ressonância Magnética Gadobutrol e expressão EBD. MR imagens antes (a e d) e depois(b e e) abertura BBB. o aprimoramento do contraste gadobutrol confirma a localização da abertura do BBB in vivo (b e e, setas). (c) Seção cerebral de 10 μm mostrando mais confirmação da abertura do BBB com autofluorescência EBD (vermelha) no hipocampo (mancha nuclear DAPI azul). Barra de escala; 500 μm. (f) Micrografo de uma seção cerebral de 10 μm após a abertura do BBB no córtex cingulado anterior evidente pela autofluorescência vermelha EBD (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Entrega localizada de AAV9-hsyn-GFP para o hipocampo via abertura DO FUS BBB. Confirmação de ressonância magnética de abertura do BBB com agente de contraste de ressonância magnética, contraste de ressonância magnética (setas) em imagens coronais (a) e axial (b)ponderadas T1. (c) confirmação histológica da expressão GFP no hipocampo alvo de FUS (verde) 3 semanas após a abertura do FUS BBB e injeção AAV9-hsyn-GFP IV. Azul indica mancha nuclear DAPI para morfologia celular global. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos uma abordagem benchtop para microbolhas assistida fus bbb abertura com abordagens alternativas, incluindo, dois transdutores diferentes e métodos para direcionamento intracraniano com e sem orientação de ressonância magnética. Atualmente, para estabelecer a abertura do FUS BBB guiado por RESSONÂNCIA Magnética no laboratório, há a opção de comprar excelentes dispositivos prontos para uso que fornecem resultados altamente padronizados e reprodutíveis com interfaces fáceis de usar. No entanto, muitos laboratórios não estão preparados para o custo de tais instrumentos. Portanto, o principal objetivo deste protocolo é fornecer um ponto de partida que qualquer laboratório possa estabelecer para construir sua expertise na técnica.
A abertura do FUS BBB é hoje uma técnica amplamente utilizada e muitas vezes é o caso de diferentes grupos utilizarem uma variedade de agentes e anestésicos, cada um dos quais pode afetar o grau de abertura e extravasão do BBB. É importante ressaltar que o anestésico em particular utilizado pode afetar a magnitude da abertura do BBB, por isso é importante considerar isso ao executar este protocolo38. Aqui, o isoflurane anestésico é usado porque os animais podem ser mantidos sob isoflurane durante o comprimento do protocolo e os níveis de gás isoflurane podem ser facilmente ajustados com base na frequência de respiração do animal e na frequência cardíaca. Além disso, entregamos isoflurane com oxigênio porque era mais acessível do que o ar médico; no entanto, o ar médico pode permitir uma abertura mais extensa do BBB39. Alguns agentes de contraste de ressonância magnética são mais apropriados para este protocolo do que outros. Por exemplo, em nossas mãos, o gadoteridol não produziu nenhum aprimoramento de contraste mesmo quando o vazamento de EBD estava claramente presente no tecido após a morte. A formulação de microbolhas também é importante. Aqui usamos microesferas lipídicas perflutren. Outras formulações de microbolhas, como microbolhas tipo proteína perflutren A, estão prontamente disponíveis, mas o tipo de microbolhas utilizadas afetará os resultados15.
Os controles dos geradores de função podem variar bastante, por isso consulte o manual para obter instruções sobre como inserir as configurações listadas na etapa 1. A tensão de comando apropriada (pico V para pico no gerador de função) depende fortemente das propriedades do transdutor, ganho do amplificador RF, amplificador RF para correspondência de transdutor, idade e tamanho do animal, tipo de microbolhas e concentração, e o efeito de tratamento desejado. O pico para o pico V precisará ser determinado por tentativa e erro. Comece com as configurações sugeridas na etapa 1 e determine o efeito histologicamente. Se houver danos teciduais, abaixe o pico para o pico V em 10% e tente novamente. Da mesma forma, se não houver BBBO, então eleve o pico para o pico V em 10% e tente novamente. A configuração muito alta de um V pode danificar o transdutor de imersão de baixa potência. Isso será aparente como uma rachadura ou distorção da face do transdutor. Os tempos de fabricação dos transdutores podem ser longos, por isso, ao iniciar, sugerimos comprar mais de um transdutor como backup. Transdutores de ultrassom também podem danificar amplificadores se forem indevidamente combinados. Para simplicidade e confiabilidade, sugerimos o uso de um amplificador de potência robusto que possa conduzir cargas complexas (como o amplificador de energia RF na tabela de materiais). Note que enquanto o transdutor de alta potência vem com um circuito correspondente, o transdutor de imersão de baixa potência não. O amplificador RF sugerido pode lidar com a potência refletida do transdutor mal combinado, mas alguns amplificadores podem ser danificados nesta configuração. Além disso, se a etapa 2.7 se mostrar problemática após a instalação do driver e do software, verifique duas vezes se a porta serial adequada está selecionada no software. Em seguida, tente um cabo serial diferente. Se isso falhar, procure o suporte de TI local.
A partir da experiência, será preciso prática e múltiplos ajustes para alcançar uma precisão apertada na segmentação da região cerebral. Isso pode ser visto nas diferenças de direcionamento entre os primeiros experimentos(Figura 3) e os experimentos mais recentes(Figura 5). Começamos os experimentos usando um quadro estereotaxic clássico e incluí-lo como uma opção aqui se não houver acesso a uma impressora 3D ou se não houver acesso à ressonância magnética de roedores. No entanto, a orientação de ressonância magnética com fiduciais de ressonância magnética e o quadro imprimível 3D fornecido (ou de um design personalizado) é o método ideal. Primeiro, ele explica as diferenças individuais entre os animais, reunindo coordenadas dentro do animal em vez de depender de um atlas cerebral de rato médio. Além disso, o uso da Ressonância Magnética permite a confirmação do local de FUS direcionado in vivo em vez de depender da expressão EBD pós-morte. Isso é importante na entrega de agentes que podem precisar de mais de 24 horas para fazer efeito, como AAVs(Figura 5). Por fim, o porta-quadros fornecido permite devolver o animal de volta à mesma posição após a ressonância magnética para corrigir quaisquer erros de mira ou repetir o FUS após a abertura insuficiente do BBB sem ter que refazer as coordenadas. O quadro estereíxico impresso em 3D portátil pode ser usado em qualquer ressonância magnética com um furo claro de 200 mm ou mais largo.
Dependendo da distribuição dos vasos sanguíneos no local alvo, a espessura do crânio40, a presença de ventrículos e outros fatores o grau de abertura do BBB pode variar. Por essa razão, fornecemos um método para alvos repetidos com o porta-quadros e porta-quadros. A precisão do targeting depende criticamente de manter o foco do transdutor em um local consistente em relação ao ponteiro de destino. A ponta deste ponteiro deve indicar a localização no espaço do centro do foco do transdutor quando o transdutor estiver ligado ao posicionador XYZ. Os ímãs permitem que o ponteiro e o transdutor sejam facilmente trocados mantendo esta colocalização. O orifício e a saliência nos ímãs devem coincidir o mais precisamente possível. Qualquer variabilidade nesta conexão reduz a repetibilidade do alvo de foco de FUS. No entanto, haverá um deslocamento espacial entre a ponta do ponteiro e o foco do ultrassom. Uma vez confirmado que o deslocamento é consistente, ele pode ser corrigido usando as imagens mr para calcular a diferença em mm do local de abertura BBB resultante (localização de contraste de ressonância magnética) e o local de destino pretendido. Essa diferença pode então ser fatorada no local nulo. A precisão e a repetibilidade também se beneficiam muito do uso da mesma frequência de ultrassom e do uso de ratos de tamanho e idade semelhantes em um determinado conjunto de experimentos. A atenuação do ultrassom pelo cérebro de rato e crânio de rato varia de acordo com a frequência e o tamanho do crânio e a espessura do crânio varia de acordo com a idade. O crânio também é uma pequena cavidade em relação ao pulso de ultrassom e o ultrassom incidente interage com reflexos dentro do crânio para produzir um campo sonoro complexo que depende do tecido, crânio, frequência e posição do transdutor40.
Como dito em outros lugares, este protocolo visa fornecer uma alternativa de baixo investimento para excelentes soluções comerciais compatíveis com ressonância magnética que já estão disponíveis para compra. Existem limitações importantes que resultam em manter o custo baixo. Há também limitações inerentes à técnica dada à física e ao estado atual da arte. Notavelmente, apesar dessas limitações, e como mostrado nos resultados representativos, podemos alcançar a entrega consistente de corantes, partículas e vírus para o hipocampo de ratos com precisão submlímmetro. As limitações mais importantes são que (1) a forma do foco de FUS depende do tecido interveniência e, especialmente, da forma e espessura do crânio{{}. A necessidade de remover o animal da ressonância magnética para realizar o tratamento de FUS evita feedback em tempo real sobre a localização e intensidade do foco de FUS. Sem esse feedback em tempo real, vários experimentos precisam ser feitos para confirmar a configuração de cada combinação de localização de destino. Uma vez que as configurações são "discadas", encontramos boa repetibilidade. (2) O posicionamento XYZ e o sistema fiducial construídos, embora precisos, não fornecem precisão no quadro de coordenadas do posicionador do experimento ao experimento. As localizações relativas da casa XYZ, o crânio do roedor, e a moldura podem se mover em relação umas às outras de experimento para experimento. Isso é evitado pelo uso de uma imagem de ressonância magnética para direcionamento, um ponteiro de mira e fiduciário com localização conhecida no espaço em relação ao foco de FUS, garantindo que o sistema de coordenadas de ressonância magnética seja paralelo ao sistema de posicionamento XYZ, fazendo tratamentos de teste antes do conjunto de tratamentos reais e fazendo todo o procedimento dentro de uma sessão para que o animal não precise ser reposicionado no quadro. Observe que, como apenas um fiducial é usado, as rotações de quadros não são corrigíveis, por isso é fundamental garantir que o quadro esteja nivelado em relação à cama de ressonância magnética e ao furo. Em resumo, a localização do ponteiro não indica o verdadeiro foco de FUS, mas descobrimos que o deslocamento é consistente para uma determinada localização cerebral, desde que o crânio não gire em relação ao transdutor de ultrassom. Observe também que o tempo consistente de entrega de gadobutrol em relação à abertura do BBB e a imagem é crucial para resultados consistentes, especialmente se a alteração de contraste de ressonância magnética for usada como proxy para a quantidade de abertura do BBB (ver 36).
Começamos a abertura do FUS BBB no laboratório com o transdutor de imersão de baixa potência descrito acima. Descobrimos que é uma opção acessível para começar com essa técnica. Mais importante, a adaptação deste protocolo pode fornecer uma alternativa não invasiva à cirurgia estereotaxal intracraniana e pesquisas pré-clínicas realizadas com essa técnica podem ser consideradas altamente translacionais devido ao uso atual de MEr transcraniano em humanos30,32,41. Uma vez estabelecida em laboratório, essa técnica pode ser usada como uma alternativa não invasiva à cirurgia estereotipada. Assim, transformando uma ferramenta estritamente investigativa em uma ferramenta altamente translacional. Nosso laboratório usará essa técnica para a ressonância magnética guiada, a entrega localizada de vírus e nanopartículas para desenvolver novas técnicas de neuromodulação não invasivas que podem ser usadas para se comportar livremente em roedores acordados e primatas não humanos. O trabalho atual se concentra em Drogas Projetistas Exclusivamente Projetadas para Receptores de Designer (DREADDs) e na sensibilização dos neurônios para baixas doses de partículas de alta energia, como raios-x. O laboratório também está trabalhando em uma nova versão deste protocolo que pode ser realizada em um scanner 3 T humano para eliminar a necessidade de mover o animal durante o tratamento e permitir feedback de segmentação em tempo real.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte por uma bolsa de Infraestrutura de Pesquisa da NSF EPSCoR para a Universidade Clemson (1632881). Além disso, esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Os autores reconhecem com gratidão o uso dos serviços e instalações da Universidade do Alabama em Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Os autores reconhecem Rajiv Chopra por seu apoio e orientação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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