Высокое разрешение Картирование белково-ДНК взаимодействий в мышь стволовых клеток полученных нейронов с использованием хроматина иммунопреципиентации-экзонуклеазы (ChIP-Exo)
Summary
Точное определение белково-связывающих мест в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Здесь мы описываем метод геномного картирования, который лечит хроматин-иммунопреципиентированную ДНК с помощью пищеварения экзонуклеазы (ChIP-exo), за которым следует секвенирование высокой пропускной способности. Этот метод обнаруживает взаимодействие белка и ДНК с почти разрешением отображения базовой пары и высоким соотношением сигнала к шуму у нейронов млекопитающих.
Abstract
Определение специфических взаимодействий белка и ДНК в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Иммунопреципиентация хроматина в сочетании с высокопрофильным секвенированием (ChIP-seq) широко используется для определения геномных связывающих мест связывания ДНК-связывающих белков. Однако метод ChIP-seq ограничен своей неоднородностью в длине звуковых фрагментов ДНК и неспецифической фоновой ДНК, что приводит к низкому разрешению карт и неопределенности в местах связывания ДНК. Чтобы преодолеть эти ограничения, сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) использует от 5′ до 3′ пищеварения экзонуклеазы, чтобы обрезать неоднородно размера иммунопрециозной ДНК к белково-ДНК кроссссылки сайта. Экзонуклеазное лечение также устраняет неспецифическую фоновую ДНК. Подготовленная к библиотеке и экзонуклеазная ДНК может быть отправлена для секвенирования с высокой пропускной способностью. Метод ChIP-exo позволяет почти базовое разрешение отображения с большей чувствительностью обнаружения и уменьшенным фоновым сигналом. Оптимизированный протокол ChIP-exo для клеток млекопитающих и секвенирования следующего поколения описан ниже.
Introduction
Расположение белково-ДНК-взаимодействий дает представление о механизмах регуляции генов. Хроматин иммунопреципиентации в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования (ChIP-seq) был использован в течение десяти лет для изучения генома всей белково-ДНК взаимодействия вживых клетках 1,2. Тем не менее, метод ChIP-seq ограничен неоднородностью в фрагментации ДНК и несырьемого загрязнения ДНК, которые приводят к низкому разрешению отображения, ложным срабатываниям, пропущенным вызовам и неспецифическому фоновому сигналу. Сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) улучшает метод ChIP-seq, обрезая ДНК ChIP к точкам скрещивания белка-ДНК, обеспечивая почти разрешение базовой пары и низкий фоновыйсигнал 3,4,5. Значительно улучшенное разрешение отображения и низкий фон, предоставляемый ChIP-exo, позволяют определить точные и всеобъемлющие места связывания белковой ДНК по всему геному. ChIP-exo способен выявить функционально различные ДНК-связывающие мотивы, совместные взаимодействия между транскрипционными факторами (TF), и несколько белково-ДНК перекрестных сайтов в определенном геномном месте связывания, не обнаруживаемых другими методамигеномного картирования 3,4,6,7.
ChIP-exo первоначально был использован в начинающих дрожжей для изучения последовательности конкретных ДНК связывания TFs, для изучения точной организации транскрипции до начала комплекса, и суб-нуклеосомной структуры отдельных гистонов черезгеном 4,8,9. С момента своего введения в 2011году 4, ChIP-экзо был успешно использован во многих других организмах, включая бактерии,мыши, и человеческие клетки 7,10,11, 12,13,14,15,16,17. В 2016 году Rhee et al.14 впервые использовали ChIP-exo в нейронах млекопитающих, чтобы понять, как поддерживается экспрессия генов нейронов после регулирования программирования TF Lhx3, который образует гетенодимерный комплекс с другим программированием TF Isl1. Это исследование показало, что в отсутствие Lhx3, Isl1 набирается на новые усилители нейронов связаны Onecut1 TF для поддержания экспрессии генов нейронального эффектора. В этом исследовании, ChIP-экзо показал, как несколько TFs динамически распознают тип клетки и клеточной стадии конкретных элементов РЕГУЛИРОВАНИЯ ДНК в комбинаторной образом при почти нуклеотидного отображения резолюции. Другие исследования также использовали метод ChIP-exo, чтобы понять взаимодействие белков и ДНК в других линиях клеток млекопитающих. Han et al.7 использовали ChIP-exo для изучения генома всей организации GATA1 и TAL1 TFs в клетках эритроидов мыши с помощью ChIP-exo. Это исследование показало, что TAL1 непосредственно набирается в ДНК, а не косвенно через белково-белковые взаимодействия с GATA1 на протяжении всей эритроидной дифференциации. Недавние исследования также использовали ChIP-экзо для профиля генома всей связывающих местах CTCF, РНК Полимераза II, и гистон знаки для изучения эпигеномных и транскрипционных механизмов вчеловеческих клеточных линий 18,19.
Есть несколько версий протокола ChIP-exo доступны3,5,20. Тем не менее, эти протоколы ChIP-exo трудно следовать для исследований, которые не знакомы с подготовкой библиотеки последовательности следующего поколения. Отличная версия протокола ChIP-exo была опубликована с простыми инструкциями и видео21, но содержала много энзиматических шагов, которые требуют значительного количества времени для завершения. Здесь мы сообщаем о новой версии протокола ChIP-exo, содержащей уменьшенные энзиматические шаги и инкубационые времена, а также объяснения для каждого энзиматичногошага 21. Конечный ремонт и dA-хвостовые реакции объединяются в один шаг с использованием фермента энд-подготовки. Время инкубации для этапов перевязки индекса и универсального адаптера сокращается с 2 ч до 15 мин с помощью усилителя перевязки. Реакция киназы после шага перевязки адаптера индекса, описанного в предыдущем протоколе ChIP-exo, удаляется. Вместо этого, фосфатная группа добавляется во время синтеза ДНК олиго к одному из 5′ концов адаптера индекса(таблица 1), который будет использоваться для шага пищеварения экзонуклеазы лямбды. В то время как предыдущий протокол ChIP-exo использовал переваривание exonuclease RecJf для устранения одноядерных загрязнителей ДНК, этот шаг пищеварения удаляется здесь, потому что он не имеет решающего значение для качества библиотеки ChIP-exo. Кроме того, для очистки обратной поперечной ДНК после элюции ChIP вместо метода извлечения фенола:хлороформа:изоамилового спирта (PCIA) используется метод очистки магнитных бусин. Это сокращает время инкубации ДНК-извлечения. Важно отметить, что он удаляет большинство адаптер димеров, сформированных во время перевязки адаптера индекса, что может повлиять на эффективность перевязки опосредованного ПЦР.
Представленный здесь протокол ChIP-exo оптимизирован для обнаружения точных взаимодействий белка и ДНК в нейронах млекопитающих, дифференцированных от клеток эмбрионального ствола мыши (ES). Кратко, собранные и перекрестные нейронные клетки лизированы, чтобы позволить хроматин подвергаться sonication, а затем sonicated так, что соответствующие размеры фрагментов ДНК получены (Рисунок 1). Бусы с покрытием антител затем используются для селективного иммунопреципитата фрагментированного, растворимого хроматина к интересному белку. В то время как иммунопрофилированная ДНК все еще находится на бисере, проводится конечный ремонт, перевязка секвенирования адаптеров, реакция заполнения и шаги пищеварения лямбда экзонуклеазы от 5′ до 3′ lambda exonuclease. Этап пищеварения экзонуклеазы дает ChIP-exo его сверхвысокое разрешение и высокое соотношение сигнала к шуму. Lambda exonuclease обрезает иммунопрофилированные ДНК несколько базовых пар (bp) от перекрестного сайта, в результате чего загрязняющих ДНК будет деградировать. Экзонуклеазы обработанных ChIP ДНК eluted из антител покрытием бисера, белка-ДНК перекрестные обратные, и белки деградируют. ДНК извлекается и денатурирована до одной нити ДНК ChIP, а затем грунтовка annealing и расширение, чтобы сделать двойную мель ДНК (dsDNA). Далее проводится перевязка универсального адаптера к экзонуклеазным концам. Полученная ДНК очищается, затем ПЦР усиливается, очищается гелем и подвергается секвенированию следующего поколения.
Протокол ChIP-exo длиннее протокола ChIP-seq, но не очень технически сложный. Любая успешно иммунопрофилированная ДНК ChIP может быть подвергнута ChIP-экзо, с несколькими дополнительными энзиматичными шагами. Заметные преимущества ChIP-exo, такие как сверхвысокое разрешение отображения, уменьшенный фоновый сигнал и снижение ложноположительного и отрицательного, в отношении сайтов связывания геномных, перевешивают стоимость времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, ChIP следуют пищеварения экзонуклеазы используется для получения библиотек ДНК для выявления белково-ДНК взаимодействий в клетках млекопитающих при сверхвысоком разрешении отображения. Многие переменные способствуют качеству эксперимента ChIP-exo. Критические эксперим…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудника лаборатории Rhee за обмен неопубликованными данными и ценные дискуссии. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) грант RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L., A, J. e. l. t. s. c. h., Rots, M. G. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
