Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.
Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die door vrijwel alle cellen worden afgegeven en in alle biologische vloeistoffen worden uitgescheiden. Er zijn veel methoden ontwikkeld voor de isolatie van deze blaasjes, waaronder ultracentrifugatie, ultrafiltratie en chromatografie met uitsluiting van grootte. Ze zijn echter niet allemaal geschikt voor grootschalige exosoomzuivering en -karakterisering. Hier wordt een protocol beschreven voor het opzetten van culturen van primaire fibroblasten geïsoleerd uit skeletspieren van volwassen muizen, gevolgd door zuivering en karakterisering van exosomen uit de kweekmedia van deze cellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van opeenvolgende centrifugatiestappen gevolgd door sucrosedichtheidsgradiënten. De zuiverheid van de exosomale preparaten wordt vervolgens gevalideerd door western blot-analyses met behulp van een reeks canonieke markers (d.w.z. Alix, CD9 en CD81). Het protocol beschrijft hoe bioactieve exosomen kunnen worden geïsoleerd en geconcentreerd voor elektronenmicroscopie, massaspectrometrie en opname-experimenten voor functionele studies. Het kan gemakkelijk worden opgeschaald of verkleind en aangepast voor exosoomisolatie uit verschillende celtypen, weefsels en biologische vloeistoffen.
Exosomen zijn heterogene extracellulaire blaasjes met een grootte van 30-150 nm. Ze zijn gevestigde sleutelspelers in fysiologische en pathologische processen, gezien hun alomtegenwoordige verspreiding in weefsels en organen 1,2. Exosomen dragen een complexe lading eiwitten, lipiden, DNA-typen en RNA-typen, die variëren afhankelijk van het type cellen waaruit ze zijn afgeleid 1,2,3. Exosomen zijn verrijkt met eiwitten die verschillende functies hebben (d.w.z. tetraspanines, waaronder CD9 en CD63) die verantwoordelijk zijn voor fusiegebeurtenissen. Zo zijn heat shock-eiwitten HSP70 en HSP90 betrokken bij de binding en presentatie van antigeen. Bovendien nemen Alix, Tsg101 en flottilline deel aan de biogenese en afgifte van exosomen en worden ze veel gebruikt als markers van deze nanoblaasjes 2,3,4.
Exosomen bevatten ook een verscheidenheid aan RNA’s (d.w.z. microRNA’s, lange niet-coderende RNA’s, ribosomale RNA’s) die kunnen worden overgebracht naar ontvangende cellen, waar ze stroomafwaartse signalering beïnvloeden3. Omdat het wordt omsloten door een membraan van één eenheid, hangt de bioactiviteit van exosomen niet alleen af van de lading eiwitten en nucleïnezuren, maar ook van lipidecomponenten van het beperkende membraan1. Exosomale membranen zijn verrijkt met fosfatidylserine, fosfatidinezuur, cholesterol, sfingomyeline, arachidonzuur en andere vetzuren, die allemaal de exosoomstabiliteit en membraantopologie kunnen beïnvloeden 2,3. Als gevolg van de lading- en lipidenrangschikking initiëren exosomen signaalroutes in ontvangende cellen en nemen ze deel aan het behoud van de normale weefselfysiologie 1,2,4,5. Onder bepaalde pathologische omstandigheden (d.w.z. neurodegeneratie, fibrose en kanker) is aangetoond dat ze pathologische stimuli veroorzaken en verspreiden 4,6,7,8,9,10,11.
Vanwege hun vermogen om signalen te verspreiden naar naburige of verre locaties, zijn exosomen waardevolle biomarkers geworden voor de diagnose of prognose van ziektetoestanden. Bovendien zijn exosomen experimenteel gebruikt als voertuigen van therapeutische verbindingen 2,12. De mogelijke toepassing van deze nanoblaasjes in de kliniek maakt de isolatiemethode steeds belangrijker om maximale opbrengst, zuiverheid en reproduceerbaarheid te bereiken. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld en geïmplementeerd voor de isolatie van exosomen. Over het algemeen kunnen exosomen worden geïsoleerd uit geconditioneerde celkweekmedia of lichaamsvloeistoffen door differentiële centrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie en immuunvangst (met behulp van in de handel verkrijgbare kits). Elke benadering heeft unieke voor- en nadelen die eerder zijn besproken 1,2,13,14.
Het geschetste protocol richt zich op de 1) isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen en 2) zuivering en karakterisering van exosomen die door deze cellen in het kweekmedium worden afgegeven. Een goed ingeburgerd protocol voor de isolatie van exosomen uit primaire fibroblasten voor functionele studies ontbreekt momenteel. Primaire fibroblasten scheiden geen grote hoeveelheden exosomen af, waardoor het isolatie- en zuiveringsproces een uitdaging is. Dit protocol beschrijft de zuivering van grote hoeveelheden zuivere exosomen uit grote kweekvolumes met behoud van hun morfologische integriteit en functionele activiteit. Gezuiverde exosomen verkregen uit geconditioneerd medium zijn met succes gebruikt in in vitro opname-experimenten om specifieke signaalroutes in ontvangende cellen te induceren. Ze zijn ook gebruikt voor vergelijkende proteomische analyses van exosomale ladingen uit meerdere biologische monsters4.
Een cruciale stap voor de succesvolle isolatie van exosomen uit de kweekmedia, zoals beschreven in dit protocol, is de juiste vestiging en instandhouding van primaire fibroblastculturen van muizen uit volwassen skeletspieren. Deze culturen moeten op een laag zuurstofgehalte worden gehouden om fysiologisch achtige omstandigheden te garanderen (O2-niveau in skeletspieren is ~2,5%)15. Primaire fibroblasten zullen van karakter veranderen wanneer ze te vaak in cultuur worden gebracht. Daarom…
The authors have nothing to disclose.
Alessandra d’Azzo bekleedt de Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair in Genetics and Gene Therapy. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies R01GM104981, RO1DK095169 en CA021764, de Assisi Foundation of Memphis en de American Libanese Syrian Associated Charities.
10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
Running buffer | BioRad | 1610732 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
Tris base | BioRad | 1610719 | |
Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |