Этот протокол иллюстрирует: 1) выделение и культивирование первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши, а также 2) очистку и характеристику экзосом с использованием метода дифференциального ультрацентрифугирования в сочетании с градиентами плотности сахарозы с последующим вестерн-блоттинг-анализом.
Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы, выделяемые практически всеми клетками и секретируемые во всех биологических жидкостях. Для выделения этих везикул было разработано множество методов, включая ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию и эксклюзионную хроматографию. Однако не все из них подходят для крупномасштабной очистки и характеризации экзосом. Изложен протокол создания культур первичных фибробластов, выделенных из скелетных мышц взрослых мышей, с последующей очисткой и характеристикой экзосом из питательных сред этих клеток. Метод основан на использовании последовательных стадий центрифугирования с последующими градиентами плотности сахарозы. Чистота экзосомальных препаратов затем подтверждается вестерн-блоттинг-анализом с использованием батареи канонических маркеров (например, Alix, CD9 и CD81). Протокол описывает, как выделять и концентрировать биоактивные экзосомы для электронной микроскопии, масс-спектрометрии и экспериментов по поглощению для функциональных исследований. Его можно легко увеличить или уменьшить и адаптировать для выделения экзосом из различных типов клеток, тканей и биологических жидкостей.
Экзосомы представляют собой гетерогенные внеклеточные везикулы размером от 30 до 150 нм. Они являются установленными ключевыми игроками в физиологических и патологических процессах, учитывая их повсеместное распространение в тканях и органах 1,2. Экзосомы несут сложный груз белков, липидов, типов ДНК и РНК, которые различаются в зависимости от типа клеток, из которых они получены. Экзосомы обогащены белками, которые выполняют различные функции (например, тетраспанины, включая CD9 и CD63), ответственные за события слияния. Например, белки теплового шока HSP70 и HSP90 участвуют в связывании и презентации антигена. Кроме того, Alix, Tsg101 и флотиллин участвуют в биогенезе и высвобождении экзосом и широко используются в качестве маркеров этих нановезикул 2,3,4.
Экзосомы также содержат различные РНК (т.е. микроРНК, длинные некодирующие РНК, рибосомные РНК), которые могут передаваться клеткам-реципиентам, где они влияют на последующую передачу сигналов. Биоактивность экзосомы, заключенной в единую единую мембрану, зависит не только от груза белков и нуклеиновых кислот, но и от липидных компонентов лимитирующей мембраны1. Экзосомальные мембраны обогащены фосфатидилсерином, фосфатидной кислотой, холестерином, сфингомиелином, арахидоновой кислотой и другими жирными кислотами, которые могут влиять на стабильность экзосом и топологию мембраны 2,3. В результате карго- и липидного расположения экзосомы инициируют сигнальные пути в принимающих клетках и участвуют в поддержании нормальной физиологии тканей 1,2,4,5. Было показано, что при определенных патологических состояниях (например, нейродегенерации, фиброзе и раке) они запускают и распространяют патологические стимулы 4,6,7,8,9,10,11.
Благодаря своей способности распространять сигналы в соседние или отдаленные участки, экзосомы стали ценными биомаркерами для диагностики или прогнозирования заболеваний. Кроме того, экзосомы были экспериментально использованы в качестве носителей терапевтических соединений 2,12. Потенциальное применение этих нановезикул в клинике делает метод выделения все более важным для достижения максимального выхода, чистоты и воспроизводимости. Разработаны и внедрены различные методики выделения экзосом. Как правило, экзосомы могут быть выделены из кондиционированных клеточных культуральных сред или жидкостей организма с помощью дифференциального центрифугирования, эксклюзионной хроматографии и иммунного захвата (с использованием коммерчески доступных наборов). Каждый подход имеет уникальные преимущества и недостатки, которые обсуждались ранее 1,2,13,14.
Изложенный протокол фокусируется на 1) выделении и культивировании первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши и 2) очистке и характеристике экзосом, высвобождаемых в питательную среду этими клетками. Устоявшийся протокол выделения экзосом из первичных фибробластов для функциональных исследований в настоящее время отсутствует. Первичные фибробласты не секретируют большое количество экзосом, что затрудняет процесс изоляции и очистки. Данный протокол описывает очистку больших количеств чистых экзосом от больших объемов культуры с сохранением их морфологической целостности и функциональной активности. Очищенные экзосомы, полученные из кондиционированной среды, были успешно использованы в экспериментах по захвату in vitro для индуцирования специфических сигнальных путей в клетках-реципиентах. Они также использовались для сравнительного протеомного анализа экзосомальных грузов из нескольких биологических образцов4.
Важнейшим шагом для успешного выделения экзосом из питательной среды, как указано в этом протоколе, является надлежащее установление и поддержание первичных культур фибробластов мышей из скелетных мышц взрослого человека. Эти культуры необходимо поддерживать при низком уровне кисло…
The authors have nothing to disclose.
Алессандра д’Аццо возглавляет кафедру генетики и генной терапии Фонда «Ювелиры для детей» (JFC). Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01GM104981, RO1DK095169 и CA021764, Фондом Ассизи в Мемфисе и Американо-ливанско-сирийской ассоциированной благотворительной организацией.
10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
Running buffer | BioRad | 1610732 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
Tris base | BioRad | 1610719 | |
Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |