Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster
Summary
Detta protokoll illustrerar 1) isolering och odling av primära fibroblaster från den vuxna musmuskeln gastrocnemius samt 2) rening och karakterisering av exosomer med hjälp av en differentiell ultracentrifugeringsmetod i kombination med sackarosdensitetsgradienter följt av western blot-analyser.
Abstract
Exosomer är små extracellulära vesiklar som frigörs av praktiskt taget alla celler och utsöndras i alla biologiska vätskor. Många metoder har utvecklats för isolering av dessa vesiklar, inklusive ultracentrifugering, ultrafiltrering och storleksuteslutningskromatografi. Alla är dock inte lämpliga för storskalig exosomrening och karakterisering. Här beskrivs ett protokoll för att etablera odlingar av primära fibroblaster isolerade från vuxna musskelettmuskler, följt av rening och karakterisering av exosomer från odlingsmedia i dessa celler. Metoden är baserad på användning av sekventiella centrifugeringssteg följt av sackarosdensitetsgradienter. Renheten hos de exosomala preparaten valideras sedan genom western blot-analyser med hjälp av ett batteri av kanoniska markörer (dvs. Alix, CD9 och CD81). Protokollet beskriver hur man isolerar och koncentrerar bioaktiva exosomer för elektronmikroskopi, masspektrometri och upptagsexperiment för funktionella studier. Den kan enkelt skalas upp eller ner och anpassas för exosomisolering från olika celltyper, vävnader och biologiska vätskor.
Introduction
Exosomer är heterogena extracellulära vesiklar som varierar i storlek från 30–150 nm. De är etablerade nyckelspelare i fysiologiska och patologiska processer, med tanke på deras allestädes närvarande distribution i vävnader och organ 1,2. Exosomer bär en komplex last av proteiner, lipider, DNA-typer och RNA-typer, som varierar beroende på vilken typ av celler de härrör från 1,2,3. Exosomer är anrikade i proteiner som har olika funktioner (dvs. tetraspaniner, inklusive CD9 och CD63) är ansvariga för fusionshändelser. Till exempel är värmechockproteinerna HSP70 och HSP90 involverade i antigenbindning och presentation. Dessutom deltar Alix, Tsg101 och flotillin i exosombiogenes och frisättning och används ofta som markörer för dessa nanovesiklar 2,3,4.
Exosomer innehåller också en mängd olika RNA (dvs. mikroRNA, långa icke-kodande RNA, ribosomala RNA) som kan överföras till mottagarceller, där de påverkar nedströms signalering3. Exosomens bioaktivitet är innesluten av ett enda enhetsmembran och beror inte bara på lasten av proteiner och nukleinsyror, utan också på lipidkomponenterna i det begränsande membranet1. Exosomala membran är berikade med fosfatidylserin, fosfatidinsyra, kolesterol, sfingomyelin, arakidonsyra och andra fettsyror, som alla kan påverka exosomstabilitet och membrantopologi 2,3. Som ett resultat av last- och lipidarrangemanget initierar exosomer signalvägar i mottagande celler och deltar i upprätthållandet av normal vävnadsfysiologi 1,2,4,5. Under vissa patologiska tillstånd (t.ex. neurodegeneration, fibros och cancer) har de visat sig utlösa och sprida patologiska stimuli 4,6,7,8,9,10,11.
På grund av deras förmåga att sprida signaler till närliggande eller avlägsna platser har exosomer blivit värdefulla biomarkörer för diagnos eller prognos av sjukdomstillstånd. Dessutom har exosomer använts experimentellt som bärare av terapeutiska föreningar 2,12. Den potentiella tillämpningen av dessa nanovesiklar i kliniken gör isoleringsmetoden allt viktigare för att uppnå maximalt utbyte, renhet och reproducerbarhet. Olika tekniker för isolering av exosomer har utvecklats och implementerats. I allmänhet kan exosomer isoleras från konditionerade cellodlingsmedier eller kroppsvätskor genom differentiell centrifugering, storleksuteslutningskromatografi och immuninfångning (med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit). Varje tillvägagångssätt har unika fördelar och nackdelar som har diskuterats tidigare 1,2,13,14.
Det skisserade protokollet fokuserar på 1) isolering och odling av primära fibroblaster från vuxna möss gastrocnemiusmuskel och 2) rening och karakterisering av exosomer som frigörs i odlingsmediet av dessa celler. Ett väletablerat protokoll för isolering av exosomer från primära fibroblaster för funktionella studier saknas för närvarande. Primära fibroblaster utsöndrar inte stora mängder exosomer, vilket gör isolerings- och reningsprocessen utmanande. Detta protokoll beskriver rening av stora mängder rena exosomer från stora odlingsvolymer samtidigt som deras morfologiska integritet och funktionella aktivitet bibehålls. Renade exosomer erhållna från konditionerat medium har använts framgångsrikt i in vitro-upptagsexperiment för att inducera specifika signalvägar i mottagarceller. De har också använts för jämförande proteomikanalyser av exosomala laster från flera biologiska prover4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett kritiskt steg för en framgångsrik isolering av exosomer från odlingsmedia, som beskrivs i detta protokoll, är korrekt etablering och underhåll av primära musfibroblastkulturer från vuxen skelettmuskulatur. Dessa kulturer måste hållas vid en låg syrenivå för att säkerställa fysiologiskt liknande förhållanden (O2-nivån i skelettmuskulaturen är ~2,5 %)15. Primära fibroblaster kommer att ändra egenskaper när de passerar i odling för många gånger. Därför är ett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo innehar Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair i genetik och genterapi. Detta arbete stöddes delvis av NIH-anslag R01GM104981, RO1DK095169 och CA021764, Assisi Foundation of Memphis och American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
References
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
