Summary
Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel unter Verwendung der Echtzeitüberwachung der elektrischen Impedanz infizierter Zellen beschrieben. Eine praktische Anwendung dieser Methode wird durch die Quantifizierung des Influenza-A-Virus-Zerfalls unter verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern, die Umweltbedingungen nachahmen, vorgestellt.
Abstract
Methoden zur Quantifizierung von Viruspartikeln stellen einen kritischen Aspekt vieler virologischer Studien dar. Obwohl es mehrere zuverlässige Techniken gibt, sind sie entweder zeitaufwendig oder nicht in der Lage, kleine Variationen zu erkennen. Hier wird ein Protokoll zur präzisen Quantifizierung des viralen Titers vorgestellt, indem elektrische Impedanzvariationen infizierter Zellen in Echtzeit analysiert werden. Die zelluläre Impedanz wird durch Goldmikroelektroden-Biosensoren gemessen, die sich unter den Zellen in Mikroplatten befinden, wobei die Größe von der Anzahl der Zellen sowie ihrer Größe und Form abhängt. Dieses Protokoll ermöglicht eine Echtzeitanalyse der Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Morphologie und Migration mit erhöhter Sensitivität. Ebenfalls enthalten ist ein Beispiel für eine praktische Anwendung durch Quantifizierung des Zerfalls des Influenza-A-Virus (IAV), das verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt ist, die die virale Infektiosität im Laufe der Zeit beeinflussen (d. H. Temperatur, Salzgehalt und pH-Wert). Für solche Anwendungen reduziert das Protokoll den Arbeitsaufwand und generiert gleichzeitig präzise Quantifizierungsdaten von infektiösen Viruspartikeln. Es ermöglicht den Vergleich von Inaktivierungsneigungen zwischen verschiedenen IAV, was ihre Fähigkeit widerspiegelt, in einer bestimmten Umgebung zu persistieren. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen, ist hochgradig reproduzierbar und kann auf jedes Virus angewendet werden, das zytopathische Effekte in Zellkultur hervorruft.
Introduction
Die Übertragung eines Virus beruht auf der Kombination mehrerer Faktoren. Für ein virus, das in der Umwelt sezerniert wird, hängt seine Übertragung auch von der Fähigkeit ab, unter Bedingungen außerhalb des Wirts zu bestehen. Die Untersuchung der Virusinaktivierung im Allgemeinen ist daher ein entscheidender Schritt, um die nationalen Gesundheitsbehörden und politischen Entscheidungsträger bei der Umsetzung von Kontroll- und Biosicherheitsmaßnahmen zu unterstützen.
Das Wissen über die Persistenz von Viren in natürlichen und Laborumgebungen hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Bei Influenza-A-Viren (IAV) setzen ihre Übertragungswege Viruspartikel einer Vielzahl von Umweltbedingungen aus. Insbesondere können sie über 1) fäkal-orale Wege durch Wasser (d.h. Vogelviren) oder 2) direkten oder indirekten Kontakt durch kontaminierte Fomiten sowie Aerosole und Atemtröpfchen (d.h. Geflügel- und Säugetierviren)1 übertragen werden. In jedem Fall werden IAV verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern (d.h. pH-Wert, Salzgehalt, Temperatur und Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt, die ihre Infektiosität mehr oder weniger schnell beeinflussen2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere bei zoonotischen und pandemischen Viren ist es von großer Bedeutung, das Potenzial von Umweltfaktoren zur Beeinflussung der Virusdynamik und die Risiken einer Exposition und artenübergreifenden Übertragung zu bewerten.
Bisher wurden traditionelle virologische Techniken (d.h. virale Titerbestimmung durch Plaque-Assays oder 50% Abschätzung der infektiösen Dosis in der Gewebekultur) verwendet, um die IAV-Infektiosität im Laufe der Zeit zu bewerten; aber diese Techniken sind zeitaufwendig und erfordern viele Vorräte10,11,12. Die Messung der Impedanz infizierter Zellen im Laufe der Zeit mit Mikroelektroden dient als nützliches Werkzeug, um das IAV-Überleben unter verschiedenen Umweltbedingungen sowie die Virusinaktivierung im Allgemeinen zu überwachen. Diese Methode liefert objektive Echtzeitdaten, die die subjektive Beobachtung zytopathischer Effekte beim Menschen ersetzen. Es kann verwendet werden, um die Virustitration zu bestimmen, wodurch traditionelle Messungen mit niedrigeren Konfidenzintervallen ersetzt und arbeitsintensive Endpunkt-Assays vermieden werden.
Es besteht eine lineare Korrelation zwischen Titrationsergebnissen, die durch Messung der Zellimpedanz und durch klassische Plaque-Assay- oder TCID50-Methoden erhalten werden. Daher können Daten, die mit der impedanzbasierten Titrationsmethode erhalten werden, leicht in TCID50- oder pfu-Werte transformiert werden, indem eine Standardkurve mit serieller Verdünnung des Virus erstellt wird13,14,15,16,17. Der Nachweis, die Quantifizierung und die Wirksamkeit neutralisierender Antikörper in Serumproben können ebenfalls mit diesem experimentellen Ansatz erreicht werden18,19. In jüngerer Zeit wurden impedanzbasierte zelluläre Assays verwendet, um antivirale Verbindungen gegen Equid-Alphaherpesviren zu screenen und zu bewerten20.
Diese Technologie wurde verwendet, um die Persistenz von IAVs in Salzwasser bei verschiedenen Temperaturen zu bewerten und Mutationen im Hämagglutinin von IAV zu identifizieren, die die IAV-Persistenz in der Umwelt erhöhen oder verringern21. Ein solches Screening würde umfangreiche Arbeiten erfordern, wenn traditionelle Titrationsmethoden verwendet würden. Diese Methodik kann jedoch für jedes Virus verwendet werden, das sich auf die Zellmorphologie, die Zellzahl und die Stärke der Zelloberfläche auswirkt. Es kann auch verwendet werden, um die Persistenz unter verschiedenen Umgebungsbedingungen (z. B. in der Luft, im Wasser oder auf Oberflächen) zu überwachen.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet als Beispiel das IAV-Überleben im Wasser. Menschliche Influenzaviren sind über einen längeren Zeitraum verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt. Salzhaltiges (35 g/L NaCl) Wasser bei 35 °C wurde auf der Grundlage früherer Ergebnisse als Umweltmodell gewählt9. Die Restinfektiosität exponierter Viren wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zellinfektion quantifiziert. MDCK-Zellen, der Referenzzelltyp für die IAV-Amplifikation, werden auf 16 mit Mikroelektrodensensoren beschichtete Well-Mikrotiterplatten gesät und 24 h später von exponierten Viren infiziert. Die Zellimpedanz wird alle 15 Minuten gemessen und als beliebige Einheit ausgedrückt, die als Zellindex (CI) bezeichnet wird. Zytopathische Wirkungen, die durch das Influenzavirus induziert werden und deren Entstehungsrate direkt von der Anzahl der infektiösen Viruspartikel abhängt, die der Zellkultur geimpft werden, führen zu einer CI-Abnahme, die anschließend als CIT50-Wert quantifiziert wird. Dieser Wert entspricht der Zeit, die erforderlich ist, um eine Reduktion von 50% gegenüber dem ursprünglichen CI (d. h. vor der Viruszugabe) zu messen. CIT50-Werte , die für mehrere Umweltexpositionszeiten berechnet wurden, erlauben die Ableitung der Inaktivierungssteigung eines Virus nach linearer Regression der CIT50-Werte .
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Protocol
Behandeln Sie alle Influenzaviren gemäß den entsprechenden Anforderungen an die biologische Sicherheit (BSL-2 oder höher, je nach Subtyp). Verwenden Sie IAV-Stämme mit einer niedrigen Passagengeschichte (weniger als 5x auf MDCK-Zellen), um eine geringe Variation zwischen den Experimenten sicherzustellen.
1. Herstellung von Reagenzien und Ausgangsstoffen
- Präparation von MDCK-Zellen und sterilem Zellkulturmedium
- Kultivieren Sie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen in modifiziertem Eagle's Medium (MEM), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kalbserum (FCS) und Antibiotika (100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin).
- Nach dem Auftauen passieren MDCK-Zellen mindestens 2x, bevor Sie sie infizieren, um eine vollständige Genesung zu gewährleisten (aber weniger als 30 Passagen, um eine Drift in den Zellphänotypen zu vermeiden).
- Samen Sie 75 cm2 Gewebekulturkolben mit 30 ml sterilem 1x MEM mit 7,5 x 106 MDCK-Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C in befeuchtetem 5% CO2-Inkubator.
- Vorbereitung von Impedanzüberwachungsgeräten
- Stellen Sie das Gerät bei 35 °C in den Inkubator und lassen Sie es mindestens 2 h aufwärmen.
- Schließen Sie es an die Steuereinheit an, die sich außerhalb des Inkubators befindet.
- Fahren Sie mit den vom Hersteller empfohlenen Reinigungsverfahren fort, bevor Sie mit dem Rest des Experiments beginnen.
- Herstellung von IAV-Beständen auf MDCK-Zellen
- Zur Vermehrung und Amplifikation von H1N1-Viren werden 7,5 x 106 MDCK-Zellen auf zwei 75 cm2 Gewebekulturflaschen gesät und 24 h bei 37 °C inkubiert, um eine Konfluenz von 90 %–100 % zu erreichen.
- Dekantieren Sie das Zellkulturmedium aus der Zellmonoschicht in 75 cm2 Kolben. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem 1x PBS.
- Entfernen Sie PBS und fügen Sie 5 ml 1x PBS hinzu, um die Zellen erneut zu waschen.
- Beschriften Sie einen Kolben als Kontrolle und entfernen Sie PBS, bevor Sie 15 ml Virusvermehrungsmedien (1x MEM mit 0% FCS) vorsichtig auf die Monoschicht geben. Inkubieren Sie diesen Kolben in einem Inkubator, der bei 35 °C mit 5% CO2 gehalten wird. Verwenden Sie es zum Vergleich nach 3 Tagen der Vermehrung.
- Eine Durchstechflasche mit IAV-Bestand bei RT auftauen. Das Virus wird in einem 1,5-ml-Röhrchen, das Virusvermehrungsmedien enthält (1x MEM mit 0% FCS), auf die entsprechende Konzentration verdünnt.
- Entfernen Sie 1x PBS aus dem 75 cm2-Kolben und infizieren Sie MDCK-Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1 x 10-3 oder 1 x 10-4 plaquebildenden Einheiten pro Zelle (pfu / Zelle), indem Sie 1 ml des verdünnten Virus in die Zellmonoschicht geben.
- Adsorbieren Sie das Virus an MDCK-Zellen für 45 min bei RT, indem Sie den Kolben regelmäßig alle 15 min umrühren.
- Entfernen Sie vorsichtig das Inokulum und geben Sie 15 ml Virusvermehrungsmedien pro Kolben hinzu, die 1 μg/ml TPCK-Trypsin (Trypsin/L-1-tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon) enthalten, um das virale Hämagglutinin HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten zu spalten (ein Ereignis, das für die HA-Fusion mit der endosomalen Membran und die Freisetzung des viralen Genoms erforderlich ist)22.
- Inkubieren Sie die Kolben bei 35 °C und 5% CO2 für mindestens 3 Tage, um das Virus zu replizieren.
- Beobachten Sie MDCK-Zellen unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und suchen Sie nach zytopathischen Effekten (CPE) auf die Zellen (durch Vergleich mit dem Zellkontrollkolben). Wenn CPE nicht vollständig ist (d. h. etwa 80% der Zellen sind vom Substrat getrennt), stellen Sie die Kolben für weitere 24 h wieder in den Inkubator.
- Wenn CPE abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Zellkulturüberstand und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
- Übertragen Sie den geklärten Überstand auf ein 15-ml-Röhrchen und aliquote Nachkommenviren auf sterile kryogene Einwegfläschchen. Stellen Sie die Kryotuben sofort bei -80 °C auf, um Viren einzufrieren und zu lagern.
2. Bestimmung einer geeigneten Zellmenge für die Infektion von Zellen
HINWEIS: Bewahren Sie die Platten bei allen Experimenten immer auf nicht elektrostatischen Oberflächen auf, z. B. auf den Papierverpackungen der Verpackung. Befolgen Sie Abschnitt 2 unten, um die am besten geeignete Konzentration von Zellen zu bestimmen, die in der elektronischen Mikrotiterplatte (als E-Platte ausgelegt) ausgesät werden sollen.
- Bereiten Sie MDCK-Zellen in 75 cm2-Kolben vor, um 24 h vor dem Experiment frisch gespaltene Zellen (ca. 80% Konfluenz) zu erhalten.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1x PBS und lösen Sie sie durch Zugabe von 3 ml 0,25% iger Trypsin-EDTA-Lösung.
- Fügen Sie 7 ml frisches Zellkulturmedium hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit Trypanblaufärbung.
- Stellen Sie die Zellkonzentration mit Zellkulturmedien auf 400.000 Zellen/ml ein. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen in zusätzlichen Röhrchen durch, um Zelldichten von 200.000 zu erhalten; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; und 6.250 Zellen/ml. Passen Sie den Verdünnungsbereich der Zellen entsprechend dem Zelltyp und ihrem Wachstumsverhalten an.
- Lassen Sie die E-Platte (Table of Materials) für einige Minuten bei RT und geben Sie 100 μL Zellkulturmedien mit einer Mehrkanalpipette zu jeder Vertiefung hinzu. Berühren Sie nicht die Elektroden der E-Plate.
- Entriegeln Sie die Halterungen und stecken Sie die Plattenfront in die Halterungstasche des Impedanzmessgeräts (Materialtabelle). Schließen Sie die Tür des Inkubators.
- Öffnen Sie die Software.
- Wählen Sie unter "Standard-Experimentmuster-Setup" die ausgewählte(n) Dockingstation(n) aus, doppelklicken Sie auf die obere Seite, und geben Sie dann den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf "Layout" und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein. Klicken Sie dann auf "Übernehmen", wenn Sie fertig sind. Klicken Sie auf "Zeitplan" | | "Schritte" "Fügen Sie einen Schritt hinzu". Die Software fügt automatisch einen Schritt von 1 s hinzu, um die Hintergrundimpedanz (CI) zu messen.
- Klicken Sie im Reiter "Ausführen" auf "Start/Weiter". Klicken Sie auf "Plot", fügen Sie alle Proben hinzu, indem Sie die entsprechenden Bohrlöcher auswählen, und stellen Sie sicher, dass der KI zwischen -0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Entfernen Sie die Platte von der Halterung.
- 100 μL jeder Zellsuspension aus Schritt 2.4 werden doppelt in die entsprechenden Vertiefungen und 100 μL Zellmedien in Vertiefungen, die als Kontrollen verwendet werden, gegeben. Lassen Sie die E-Platte bei RT 30 minuten in der Laminar-Flow-Haube, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen an den Böden der Vertiefungen zu ermöglichen.
- Stecken Sie die E-Platte in die Wiegetasche. Klicken Sie auf "Zeitplan" | "Schritt hinzufügen" in der Software und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten für 200 Wiederholungen zu überwachen. Wählen Sie dann "Start/ Weiter".
- Überprüfen und plotten Sie die CI-Daten, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche "Plot" klicken. Wählen Sie die Konzentration der Zellen, die sich kurz vor der stationären Phase 24 h nach der Aussaat auf der Platte befinden, um Zellen zu erhalten, die sich während der Virusinfektion noch in einer Wachstumsphase befinden. Die stationäre Phase ist erreicht, wenn die KI auf ihrem Maximum ist.
3. Korrelation zwischen CIT50-Werten und Vielzahl der Infektionen
- Fügen Sie 100 μL steriles 1x MEM-Kulturmedium in jede Vertiefung der E-Platte hinzu. Setzen Sie die E-Platte bei 35 °C in die Wiegetasche des Instruments ein. Messen Sie den Hintergrund wie in Schritt 2.7 beschrieben.
- Entfernen Sie die E-Platte von der Halterung.
- Säen Sie 3 x 104 frisch gespaltene MDCK-Zellen auf jede Vertiefung der elektronischen Mikrotiterplatte und züchten Sie sie für 24 h bei 35 °C mit 5% CO2 , so dass sie sich während der IAV-Infektion in einer replikativen Phase befinden.
- Infizieren Sie MDCK-Zellen mit verschiedenen 10-fachen Verdünnungen eines bekannten 6 log10 TCID50 / ml-Titers des H1N1-Virus, indem Sie die umgekehrte Pipettierung für die Reproduzierbarkeit verwenden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
- Spülen Sie MDCK-Zellen 2x mit 100 μL MEM ohne FCS (Virus Propagation Media). Achten Sie darauf, alle Medien nach der zweiten Wäsche zu entfernen, um eine weitere Verdünnung des Inokulums zu vermeiden.
- Fügen Sie 100 μL Virussuspension in jede Vertiefung mit einer Einkanalpipette hinzu. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie von links nach rechts und dann von oben nach unten in der Platte, während Sie die verbleibenden Vertiefungen mit dem Deckel abdecken.
- Setzen Sie die Platte bei 35 °C in die Wiegetasche des Instruments ein. Seien Sie sanft, um plötzliche Bewegungen zu vermeiden, die möglicherweise zu Kontaminationen führen.
- Beginnen Sie mit der Überwachung der Zellimpedanz alle 15 Minuten während mindestens 100 h, wie in Schritt 2.10 beschrieben.
- Nach den beiden Messzyklen (d. h. 30 min) pausieren Sie das Gerät, indem Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Pause" klicken und die E-Platte aus der Dockingstation entfernen.
- 1 μg/ml TPCK-Trypsin in das Virusvermehrungsmedium geben, um das virale Hämagglutinin zu spalten.
- Fügen Sie 100 μL TPCK-Trypsin enthaltende Virusvermehrungsmedien in jede Vertiefung hinzu und stecken Sie die E-Platte in die Cradle-Tasche.
- Klicken Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Start/Weiter".
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, eine Negativkontrolle zu erstellen, die den mit Schein infizierten Zellen entspricht, indem Sie die Virussuspension durch Virusvermehrungsmedien ersetzen.
4. IAV-Überlebenskinetik
- Setzen Sie IAV salzdestilliertem Wasser bei 35 °C aus und testen Sie ihre Infektiosität im Laufe der Zeit, indem Sie die Abnahme der Zellimpedanz messen.
- Salzhaltiges destilliertes Wasser durch Zugabe von NaCl zu einer Endkonzentration von 35 g/L in destilliertem Wasser zubereiten. 900 μL Salzwasser in 2 mL Kryotuben geben.
- 100 μL Virusvorrat in Salzwasser geben und die Kryotuben für 1 h, 24 h oder 48 h in einen Inkubator (35 °C, 5% CO2) geben.
- Säen Sie 100 μL (mit 3 x 104) frisch gespaltener MDCK-Zellen auf eine 16-Well-Mikrotiterplatte und wachsen Sie 24 h bei 37 °C und 5% CO2.
- Infizieren Sie Zellen mit 100 μL exponierten Viren (zuvor 10x in Kulturmedien verdünnt) unter Verwendung der reversen Pipettiermethode zur Reproduzierbarkeit durch Wiederholung von Abschnitt 3.4.
- Überwachen Sie die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 h.
5. Bewertung des Verlusts der Infektiosität
- Bestimmung von CIT50-Werten zur Quantifizierung der CI-Abnahme aufgrund virusinduzierter zytopathischer Effekte mit dem CIT50-Wert .
- Klicken Sie auf "Plot" und fügen Sie alle Beispiele hinzu, indem Sie auf "Alle hinzufügen" klicken. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle, indem Sie auf "Experimentinformationen exportieren" klicken. Betrachten Sie die anfängliche CI als zellulären Impedanzwert, der 5 h nach der Zellinfektion durch exponierte Viren gemessen wird (d. h. 24 h nach dem Seeding von MDCK-Zellen auf der E-Platte des Mikrotiters).
- Berechnen Sie den CIT50-Wert , der der erforderlichen Zeit entspricht, um eine 50%ige Abnahme gegenüber dem ursprünglichen CI zu messen. Um den CIT50-Wert zu berechnen, notieren Sie sich den CI-Wert bei 5 hpi für jede Probe. Ermitteln Sie dann den Zeitpunkt, zu dem der CI-Wert gleich der Hälfte des CI-Werts bei 5 HPI ist, indem Sie die Index- und Übereinstimmungsfunktionen in der Tabelle verwenden.
- Berechnung der mittleren Inaktivierungssteigung
- Bestimmen Sie die CIT50-Werte für jede exponierte Virussuspension zu unterschiedlichen Expositionszeiten (in Tagen).
- Berechnen Sie eine lineare Regressionssteigung aus CIT50-gezeichneten Werten, die als Inaktivierungssteigung bezeichnet und in CIT50.tag-1 ausgedrückt werden.
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Representative Results
Rohdaten, die nach 120 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von MDCK-Zellen von 15.000 bis 120.000 Zellen pro Bohrung gewonnen wurden, sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach 24 h zeigen CI-Messungen, dass sich Zellen in Vertiefungen, die mit 30.000 Zellen ausgesät waren, noch in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, und diese Zellkonzentration wurde für weitere Experimente verwendet. Abbildung 2 veranschaulicht die lineare Korrelation zwischen CIT50-Werten und der anfänglichen Multiplizität der Infektion. MDCK-Zellen werden für 24 h kultiviert und dann mit dem A/Paris/2590/2009 H1N1-Virusstamm bei einer anderen Vielzahl von Infektionen infiziert. Das anfängliche CI wird 5 h nach der Infektion gemessen.
Abbildung 3 veranschaulicht das experimentelle Verfahren, das in unseren Experimenten verwendet wurde (Panel A). Typische Ergebnisse, die eine CI-Abnahme aufgrund einer virusinduzierten zytopathischen Wirkung zeigen, sind in Panel B dargestellt. Dies sind Rohdaten, die nach der Verarbeitung durch die Software erhalten werden. CIT50-Werte wurden nach dem Export der Daten mit hilfe der Tabellenkalkulation berechnet. Nach der Berechnung von CIT50-Werten zu verschiedenen Zeitpunkten ermöglichte eine lineare Regressionsanalyse die Bestimmung der Steigung (Panel C). Virale Inaktivierungsneigungen wurden so für jedes Virus in jedem Zustand erhalten und dann verglichen, um Viren zu identifizieren, die in der untersuchten Umgebung die größte Stabilität aufwiesen.
Abbildung 4 zeigt Inaktivierungsneigungen von rekombinanten IAV-Viren, die ein genetisches Rückgrat des A/WSN/1933 H1N1-Virusstamms und einen HA und NA aus A/Neukaledonien/20/1999 H1N1-Virus (HA-NA/NC99) tragen. Nicht-synonyme Mutationen in der HA wurden eingeführt, um die Auswirkungen auf die Persistenz von Viruspartikeln außerhalb des Wirts in salzhaltigem Wasser zu untersuchen.
Durch den Vergleich mittlerer Inaktivierungssteigungen aus verschiedenen Experimenten, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden, konnten wir Aminosäuren im HA identifizieren, die ausreichten, um die virale Persistenz außerhalb des Wirts zu beeinflussen. Je niedriger die Inaktivierungsneigung, desto stabiler ist das Virus. Beispielsweise induzierte die HA/F453Y-Substitution oder HA::K147-Insertion in die HA des HA-NA/NC99-Virus einen signifikanten Anstieg der mittleren Inaktivierungssteigung auf 9,8 CIT50/Tag bzw. 9,9 CIT50/Tag im Vergleich zu Wildtyp-HA (mit einer mittleren Inaktivierungssteigung von 4,85 CIT50/Tag), wodurch sehr instabile Mutanten erzeugt wurden. Im Gegensatz dazu hatte die HA/T327A-Substitution keinen Einfluss auf die Viralstabilität bei 35 °C in Salzwasser (mittlere Inaktivierungssteigung von 6,6 CIT50/Tag). Die Methodik war daher leistungsfähig genug, um Aminosäurereste im HA-Glykoprotein zu identifizieren, die am IAV-Überleben außerhalb des Wirts beteiligt waren.
Abbildung 1: Zelltitration in Mikrotiter-E-Platte.
Serielle Verdünnungen von MDCK-Zellen wurden auf Mikrotiter-E-Platten ausgesät und das Zellwachstum wurde bis zu 100 h (200 Sweeps alle 30 Minuten) überwacht. Graue Punkte stellen die Standardabweichungen der CI dar, die doppelt gemessen werden. Die vertikale Linie bei 24 h unterstreicht, dass unter den beschriebenen Bedingungen die anfängliche Aussaat von 3 x 104 Zellen / Well eine Kultur von etwa 70% Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion ermöglichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Lineare Regression zwischen CIT50-Werten und anfänglicher Multiplizität der Infektion.
Jeder Punkt gibt den CIT50-Wert an, der für die Infektion von Zellen mit unterschiedlichen Infektionsmultiplikationen berechnet wurde. Die durchgezogene Linie stellt die lineare Regressionssteigung dar (R2 = 0,99), und gestrichelte Linien stellen die 95%igen Konfidenzintervalle dar. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung geändert21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestimmung der Inaktivierungssteigung.
(A) Viruspartikel wurden in Salzwasser bei 35 °C für 0, 1 oder 2 Tage verdünnt, und die KI wurde kontinuierlich überwacht und als Zellindex aufgetragen. (B) CI-Abnahme quantifiziert mit den CIT50-Werten , die manuell auf den Rohdaten durch vertikal gestrichelte Linien dargestellt werden. Jede Kurve stellt die Entwicklung der Zellimpedanz nach der Infektion mit Viren dar, die zunehmend Salzwasser ausgesetzt waren (rot: nicht exponiertes Virus, gelb: 24 h Exposition, grün: 48 h Exposition, dunkel: Scheininfizierte Zellen). Das anfängliche CI wurde 5 h nach der Infektion gemessen (C) Lineare Regression der CIT50-Werte , die zur Berechnung der Inaktivierungssteigung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Einfluss von nicht-synonymen Mutationen in der HA auf die IAV-Persistenz in Salzwasser.
Inaktivierungshänge reassortanter Viren, die einen HA aus A/Neukaledonien/20/1999 H1N1-Virus mit (Substitution oder Insertion) oder ohne Mutation (HAWT) tragen. Boxplots zeigten die Verteilung einzelner Inaktivierungssteigungen (sechs oder acht je nach Virus, berechnet aus verschiedenen unabhängigen Experimenten), die für jedes exponierte Virus um den Mittelwert (horizontale Linien) erhalten wurden. Mittlere Inaktivierungssteigungen wurden mit einem ANOVA-Test verglichen (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). Ref entspricht dem reassortanten Virus mit Wildtyp HA, mit dem andere Viren verglichen werden. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung geändert21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
RTCA ist eine impedanzbasierte Technologie, die zunehmend zur Echtzeitüberwachung von Zelleigenschaften wie Zelladhärenz, Proliferation, Migration und Zytotoxizität eingesetzt wird. In dieser Studie wird die Fähigkeit dieser Technologie zur Beurteilung des IAV-Überlebens außerhalb des Wirts durch messung der Virusinaktivierungssteigung nachgewiesen. Anspruchsvolle Techniken wie TCID50 und Plaque-Assays werden durch eine objektive Echtzeitbewertung der Zelllebensfähigkeit ersetzt und spiegeln so die durch das Virus induzierten zytopathischen Effekte wider. Ähnlich wie das TCID50 oder plaquebildende Einheit (pfu) korreliert auch das CIT50 linear mit der Vielzahl der Infektionen (Abbildung 2). Zu den Einschränkungen dieses Ansatzes gehört, dass diese Methode Zellen, die mit nicht-zytopathogenen Viren infiziert sind, nicht genau überwacht.
Zum Beispiel kann die Einführung einer neuen Mutation in das virale Genom ein Virus stark abschwächen und seine Zytopathogenität verringern. Im Gegensatz dazu ist die hier berechnete Inaktivierungssteigung unabhängig von der Virusreplikation und einer möglichen Virusdämpfung, da diese Steigung aus CIT50-Werten abgeleitet wird, die nach verschiedenen Zeitpunkten der Inaktivierung desselben Virus gemessen wurden. Hier wird also davon ausgegangen, dass virale Partikel, die nach diesem Inaktivierungsprotokoll noch in der Lage sind, eine Zelle zu infizieren, den gleichen Replikationsphänotyp wie Viren vor der Inaktivierung aufweisen.
Trotz höherer Kosten wird der Arbeitsaufwand mit diesem Ansatz erheblich reduziert, was vorteilhaft ist, wenn ein Projekt die Durchführung von Kinetik erfordert, mit häufigen Zeitpunkten und über einen langen Zeitraum. Wie in jedem Protokoll sind einige Schritte kritisch, und Manipulationen müssen mit Sorgfalt und Präzision durchgeführt werden. Das umgekehrte Pipettieren ist ein entscheidender Schritt, um eine präzise Dosierung der Medien zu gewährleisten, und es muss besonders darauf geachtet werden, dass eine Kontamination vermieden wird. Ebenso muss die anfängliche Zellmenge zwischen jedem Experiment gleich sein und mit einem automatisierten Zellzähler mit Trypanblaufärbung bewertet werden. Während der Überwachung des CI durch das Gerät sollte das Öffnen des Inkubators so weit wie möglich begrenzt sein.
Wenn während des Experiments mit eingeschränkter Bewegung Sorgfalt und Aufmerksamkeit geboten wird, wird das Kontaminationsrisiko gering und die Ergebnisse sind in hohem Maße reproduzierbar. Die Verteilung der Inaktivierungsneigungen auf verschiedene Viren ist signifikant unterschiedlich, so dass ein nicht-parametrischer statistischer Test verwendet wird, um die Viruspersistenz zu vergleichen. Mittlere Inaktivierungsneigungen können für alle Viren berechnet werden, die zytopathische Wirkungen in Zellkultur erzeugen, wie enterische Viren, Ebolaviren oder Coronaviren, deren Persistenz unter Umweltbedingungen derzeit untersucht wird (und wahrscheinlich mit traditionellen virologischen Methoden). In Zukunft kann diese Methode auch verwendet werden, um die Replikation verschiedener Viren zu vergleichen, den Virustropismus für mehrere Zelllinien gleichzeitig zu untersuchen und bestimmte Schritte des Viruszyklus zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
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