Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени
Summary
Здесь представлен протокол количественной оценки инфекционных вирусных частиц с использованием мониторинга электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Практическое применение данного метода представлено путем количественной оценки распада вируса гриппа А при различных физико-химических параметрах, имитирующих условия окружающей среды.
Abstract
Методы количественной оценки вирусных частиц представляют собой критический аспект многих вирусологических исследований. Хотя существует несколько надежных методов, они либо отнимают много времени, либо не могут обнаружить небольшие вариации. Здесь представлен протокол для точной количественной оценки вирусного титра путем анализа вариаций электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Клеточное сопротивление измеряется с помощью биосенсоров микроэлектрода золота, расположенных под клетками в микропластинах, величина которых зависит от количества клеток, а также их размера и формы. Этот протокол позволяет в режиме реального времени анализировать пролиферацию, жизнеспособность, морфологию и миграцию клеток с повышенной чувствительностью. Также приведен пример практического применения путем количественной оценки распада вируса гриппа А (IAV), представленного различным физико-химическим параметрам, влияющим на вирусную инфекционность с течением времени (т.е. температуре, солености и рН). Для таких приложений протокол снижает необходимую рабочую нагрузку, а также генерирует точные количественные данные инфекционных вирусных частиц. Это позволяет сравнивать склоны инактивации между различными IAV, что отражает их способность сохраняться в данной среде. Этот протокол прост в исполнении, обладает высокой воспроизводимостью и может быть применен к любому вирусу, вызывающему цитопатические эффекты в клеточной культуре.
Introduction
Передача вируса зависит от сочетания нескольких факторов. Для вируса, секретируемого в окружающей среде, его передача также зависит от способности сохраняться в условиях вне хозяина. Таким образом, изучение вирусной инактивации в целом является решающим шагом в оказании помощи национальным органам здравоохранения и лицам, формирующим политику, в осуществлении мер контроля и биобезопасности.
За последнее десятилетие значительно возросли знания о персистенции вируса в естественных и лабораторных условиях. В случае вирусов гриппа А (IAV) их пути передачи представляют вирусные частицы в широком диапазоне условий окружающей среды. В частности, они могут передаваться через 1) фекально-оральные пути через воду (т.е. птичьи вирусы) или 2) прямой или косвенный контакт зараженных фомитов, а также аэрозолей и респираторных капель (т.е. вирусов домашней птицы и млекопитающих)1. В любом случае, IAV подвергаются различным физико-химическим параметрам (т.е. рН, солености, температуре и влажности), что более или менее быстро влияет на их инфекционность2,3,4,5,6,7,8,9. Очень важно, особенно в отношении зоонозных и пандемических вирусов, оценить потенциал факторов окружающей среды, влияющих на динамику вируса, и риски воздействия и межвидовой передачи.
До настоящего времени для оценки инфекционной активности IAV с течением времени использовались традиционные методы вирусологии (т.е. определение титра вируса с помощью анализов бляшек или 50% оценка инфекционной дозы культуры тканей); но эти методы отнимают много времени и требуют многих расходных материалов10,11,12. Измерение импеданса инфицированных клеток с течением времени с помощью микроэлектродов служит полезным инструментом для мониторинга выживаемости IAV в различных условиях окружающей среды, а также вирусной инактивации в целом. Этот метод предоставляет объективные данные в режиме реального времени, которые заменяют субъективное наблюдение человека за цитопатическими эффектами. Его можно использовать для определения титрования вируса, тем самым заменяя традиционные измерения более низкими доверительными интервалами и избегая трудоемких анализов конечных точек.
Существует линейная корреляция между результатами титрования, полученными путем измерения импеданса клеток, и классическим анализом бляшек или методами TCID50. Поэтому данные, полученные методом титрования на основе импеданса, могут быть легко преобразованы в значения TCID50 или pfu путем создания стандартной кривой с последовательным разбавлением вируса13,14,15,16,17. Обнаружение, количественная оценка и эффективность нейтрализующих антител, присутствующих в образцах сыворотки, также могут быть достигнуты с использованием этого экспериментального подхода18,19. Совсем недавно клеточные анализы на основе импеданса использовались для скрининга и оценки противовирусных соединений против альфагерпесвирусов Equid20.
Эта технология была использована для оценки стойкости IAV в соленой воде при различных температурах и для выявления мутаций в гемагглютинине IAV, которые увеличивают или уменьшают стойкость IAV в окружающей среде21. Такой скрининг потребует обширной работы при использовании традиционных методов титрования. Однако эта методология может быть использована для любого вируса, который оказывает влияние на морфологию клеток, количество клеток и силу прикрепления клеточной поверхности. Он также может быть использован для мониторинга стойкости в различных условиях окружающей среды (например, в воздухе, в воде или на поверхностях).
Протокол, описанный здесь, применяет выживание IAV в воде в качестве примера. Вирусы гриппа человека подвергаются воздействию различных физико-химических показателей в течение длительных периодов времени. Соленая (35 г/л NaCl) вода при 35 °C была выбрана в качестве экологической модели на основе предыдущих результатов9. Остаточная инфекционность подвергшихся воздействию вирусов количественно определяется в разные моменты времени через клеточную инфекцию. Клетки MDCK, тип эталонных клеток для амплификации IAV, засеивают на 16 микротитрных пластинах, покрытых микроэлектродными датчиками, и заражаются облученными вирусами через 24 ч. Импеданс клеток измеряется каждые 15 мин и выражается в виде произвольной единицы, называемой клеточным индексом (CI). Цитопатические эффекты, индуцированные вирусом гриппа, скорость начала которого напрямую зависит от количества инфекционных вирусных частиц, привитых культуре клеток, приводит к снижению ДИ, которое впоследствии количественно определяется как значение CIT50 . Это значение соответствует времени, необходимому для измерения снижения на 50% от исходного ДИ (т.е. до добавления вируса). Значения CIT50 , рассчитанные на несколько раз воздействия на окружающую среду, позволяют вывести наклон инактивации вируса после линейной регрессии значений CIT50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA – это технология на основе импеданса, которая все чаще используется для мониторинга свойств клеток в режиме реального времени, таких как клеточная адгезия, пролиферация, миграция и цитотоксичность. В этом исследовании способность этой технологии оценивать выживаемость IAV вне хозяин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
