قدم هو بروتوكول لعزل القلب البطيني البشري والحيواني من شرائح عضلة القلب قطع هزاز. يمكن الحصول على غلة عالية من الخلايا المتحملة للكالسيوم (تصل إلى 200 خلية/ملغ) من كميات صغيرة من الأنسجة (<50 ملغ). البروتوكول ينطبق على عضلة القلب المعرضة لاقفوية البرد لمدة تصل إلى 36 ساعة.
إن عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية عن قلوب الحيوانات والبشر هو طريقة أساسية في أبحاث القلب. عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية الحيوانية عن طريق التسريب التاجي مع الإنزيمات الهضمية. ومع ذلك، فإن عزل عضلة القلب البشرية يشكل تحدياً لأن عينات عضلة القلب البشرية عادة لا تسمح بالانكسار التاجي، وتؤدي بروتوكولات العزل البديلة إلى نقص الغلة للخلايا القابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك، فإن عينات عضلة القلب البشرية نادرة ولا تتوفر إلا بانتظام في المؤسسات التي جراحية في القلب في الموقع. وهذا يعوق ترجمة النتائج من الحيوانات إلى أمراض القلب البشرية. هو موضح هنا بروتوكول موثوق به التي تمكن من عزل فعالة من myocytes البطينية من عضلة القلب الحيوانية والبشرية. لزيادة نسبة السطح إلى الحجم مع تقليل تلف الخلايا، يتم توليد شرائح أنسجة عضلة القلب 300 ميكرومتر سميكة من عينات عضلة القلب مع هزاز. ثم يتم هضم شرائح الأنسجة مع البروتياز والكولاجيناز. تم استخدام عضلة القلب الجرذ لإنشاء البروتوكول وقياس غلة الخلايا myocytes القابلة للحياة والمتحملة للكالسيوم عن طريق عد الخلايا الخلوية المتدفقة. وأظهرت المقارنة مع طريقة قطعة الأنسجة المستخدمة بشكل شائع عوائد أعلى بكثير من خلايا القلب على شكل قضيب (41.5 ± 11.9 مقابل 7.89 ± 3.6٪، p < 0.05). وقد تُرجم البروتوكول إلى عضلة القلب البشرية الفاشلة وغير الفاشلة، حيث كانت الغلة مماثلة كما في عضلة القلب الجرذ، ومرة أخرى، أعلى بشكل ملحوظ مما كانت عليه مع طريقة قطعة الأنسجة (45.0 ± 15.0 مقابل 6.87 ± 5.23 خلية/ملغم، p < 0.05). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تقديم البروتوكول من الممكن عزل أعداد معقولة من خلايا القلب القلبية البشرية القابلة للحياة (9-200 خلية/ملغ) من كميات دنيا من الأنسجة (<50 ملغ). وبالتالي، فإن الطريقة تنطبق على عضلة القلب صحية وفشل من قلوب الإنسان والحيوان على حد سواء. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لعزل myocytes مثير وانكماشية من عينات الأنسجة البشرية المخزنة لمدة تصل إلى 36 ح في حل القلب النابل البارد، مما يجعل الأسلوب مفيدا بشكل خاص للمختبرات في المؤسسات دون جراحة القلب في الموقع.
تقنية المنوية التي مهدت الطريق إلى رؤى هامة في علم وظائف الأعضاء cardiomyocyte هو عزل القلب البطيني الحية من قلوب سليمة1. يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لدراسة الهيكل الخلوي الطبيعي والوظيفة ، أو عواقب التجارب الحية. على سبيل المثال، لتقييم التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران الإثارة والانكماش في النماذج الحيوانية لمرض القلب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لثقافة الخلايا، والتدخلات الدوائية، ونقل الجينات، وهندسة الأنسجة، والعديد من التطبيقات الأخرى. ولذلك، أساليب فعالة لعزل القلب و القلب هي ذات قيمة أساسية للبحوث القلب الأساسية والترجمة.
عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية من الثدييات الصغيرة ، مثل القوارض ، ومن الثدييات الكبيرة ، مثل الخنازير أو الكلاب ، عن طريق ضخ القلب التاجي مع حلول تحتوي على الكولاجين الخام و / أو البروتياز. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها “معيار الذهب” لعزل القلب والخلايا العضلية، مما أدى إلى غلة تصل إلى 70٪ من الخلايا القابلة للحياة2. وقد استخدمت أيضا النهج مع قلوب الإنسان، مما أدى إلى نتائج القلب وكوسومييت مقبولة3،4،5. ومع ذلك، لأن الضخ التاجي هو ممكن فقط إذا كان القلب سليمة أو إسفين كبير عضلة القلب التي تحتوي على فرع الشريان التاجي هو متاح، معظم العينات القلبية البشرية ليست مناسبة لهذا النهج نظرا لصغر حجمها وعدم وجود الأوعية الدموية المناسبة. ولذلك ، فإن عزل القلب البشري هو التحدي.
عينات عضلة القلب الإنسان تتكون في الغالب من قطع الأنسجة ذات الحجم المتغير (حوالي 0.5 × 0.5 × 0.5 سم إلى 2 × 2 × 2 سم) ، تم الحصول عليها من خلال الخزعات الرحمية6، استئصالات الحاجز7، زرع VAD8، أو من قلوب explanted9. تبدأ الإجراءات الأكثر شيوعًا لعزل القلب والأنسجة باستخدام المقص أو المشرط. ثم يتم تعطيل الاتصالات من خلية إلى خلية عن طريق الانغماس في مخازن خالية من الكالسيوم أو منخفضة الكالسيوم. ويتبع ذلك خطوات الهضم المتعددة مع مستخلصات الإنزيم الخام أو الإنزيمات المنقية مثل البروتياز (مثل التربسين) والكولاجيناز والهيلورونيداز أو الإلستاز مما يؤدي إلى تفكك المصفوفة خارج الخلية وتحرير خلايا القلب. في الخطوة النهائية، الحرجة، تركيز الكالسيوم الفسيولوجية يجب أن يتم استعادتها بعناية، أو يمكن أن يحدث تلف الخلوية بسبب الكالسيوم مفارقة10،11،12. وهذا النهج العزلي ملائم ولكنه غير فعال عادة. على سبيل المثال، وجدت إحدى الدراسات أن ما يقرب من 1 غرام من أنسجة عضلة القلب كان مطلوبا للحصول على عدد كاف من خلايا القلب المناسبة للتجارب اللاحقة13. أحد الأسباب المحتملة لانخفاض الغلة هو طريقة قاسية نسبيا من مفروم الأنسجة. وهذا قد يضر بشكل خاص cardiomyocytes الموجودة على حواف قطعة على الرغم من أن هذه myocytes هي الأكثر احتمالا أن يطلق سراحه عن طريق الهضم الأنزيمي.
جانب آخر قد يؤثر على كفاءة العزل وجودة الخلايا التي تم الحصول عليها من عينات الإنسان هو مدة نقص التروية الأنسجة. تذكر معظم البروتوكولات أوقات النقل القصيرة إلى المختبر كشرط مسبق لتحقيق نتائج جيدة. هذا يحد من دراسة القلب البطينية البشرية إلى المختبرات مع مرافق جراحة القلب القريبة. معا، هذه القيود تعوق التحقق من النتائج الهامة من النماذج الحيوانية في أمراض القلب البشرية. بروتوكولات العزل المحسنة التي تسمح لعوائد القلب و القلب عالية من كميات صغيرة من الأنسجة، ويفضل دون أضرار جسيمة بعد تمديد أوقات النقل، ولذلك من المرغوب فيه.
وصف هنا هو بروتوكول العزل على أساس الهضم الأنزيمي من شرائح رقيقة الأنسجة عضلة القلب ولدت مع هزاز14،15. نثبت أن العزلة عن شرائح الأنسجة أكثر كفاءة بكثير من تلك التي من قطع الأنسجة المفروم مع مقص. الطريقة الموصوفة لا يسمح فقط لغلة عالية من القلب البشري قابلة للحياة من كميات صغيرة من أنسجة عضلة القلب ولكن ينطبق أيضا على العينات المخزنة أو المنقولة في محلول القلب النابل البارد لمدة تصل إلى 36 ساعة.
على الرغم من أن عزل أمراض القلب الحية تأسست منذ أكثر من 40 عاما، ولا يزال شرطا مسبقا للعديد من النهج التجريبية في أبحاث القلب، فإنه لا يزال تقنية صعبة مع نتائج لا يمكن التنبؤ بها. يتم استخدام عزل Cardiomyocyte عن طريق ضخ الشرايين التاجية مع محلول الإنزيم عادة لقلوب الحيوانات الصغيرة ويسفر عن أعداد…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر أندرياس ديندورفر من مركز والتر بريندل للطب التجريبي، LMU ميونيخ، للمساعدة في بروتوكول تشريح. لتوفير عينات الأنسجة عضلة القلب البشرية نود أن نشكر الغزالي ميناباري وكريستيان هايم من قسم جراحة القلب، مستشفى جامعة إرلانجن، هندريك ميلتينج من معهد إريك وحنا كلسمان، جامعة روهر بوخوم ومهند الكسار من قسم أمراض القلب لدى الأطفال، مستشفى إرلانجن الجامعي. للحصول على الدعم مع تدفق cytometry نود أن نشكر سيمون فولكل وزملاؤه من مركز البحوث الترجمة (TRC)، مستشفى جامعة إرلانجن. ونود أيضا أن نشكر لورينز ماكارغو وسيلين غرونينغر من معهد علم وظائف الأعضاء الخلوية والجزيئية إرلانجن على الدعم الفني الممتاز.
وقد دعم هذا العمل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في المستشفى الجامعي في جامعة إرلانغن نورنبرغ، وجامعة إرلانغن نورنبرغ.
Chemicals | |||
2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
Glucose | Merck | 50-99-7 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
Enzymes | |||
Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
Material | |||
Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
Forceps | FST | 11271-30 | |
Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |