Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon
Summary
Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg’a kadar) az miktarda dokudan (<50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.
Abstract
Ventriküler kardiyak miyositlerin hayvan ve insan kalplerinden izole edilmesi kardiyak araştırmalarda temel bir yöntemdir. Hayvan kardiyomiyositler genellikle sindirim enzimleri ile koroner perfüzyon ile izole edilir. Ancak, insan kardiyomiyositleri izole etmek zordur çünkü insan miyokardiyal numuneler genellikle koroner perfüzyona izin vermez ler ve alternatif izolasyon protokolleri canlı hücrelerin verimlerinin düşük olmasıyla sonuçlanır. Buna ek olarak, insan miyokardiyal örnekler nadirdir ve sadece düzenli olarak yerinde kalp cerrahisi olan kurumlarda mevcuttur. Bu da bulguların hayvandan insan kardiyomiyositlerine çevrilmesini engellemektedir. Burada açıklanan insan ve hayvan miyokardiyum ventriküler miyositlerin verimli izolasyon sağlayan güvenilir bir protokoldür. Hücre hasarını en aza indirirken yüzey-hacim oranını artırmak için miyokard doku dilimleri 300 m kalınlığında miyokardiyal örneklerden vibratom ile üretilir. Doku dilimleri daha sonra proteaz ve kollajenaz ile sindirilir. Sıçan miyokardiyum protokolü kurmak ve akış-sitometrik hücre sayımı ile uygulanabilir, kalsiyuma dayanıklı miyositlerin verimlerini ölçmek için kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan doku-öbek yöntemi ile karşılaştırıldığında çubuk şekilli kardiyomiyositlerin (41.5 ± 11.9 vs. %7.89 ± %3.6, p < 0.05) önemli ölçüde daha yüksek verimi saptandı. Protokol, verimin fare miyokardiyumundakine benzer olduğu ve yine doku-öbek yöntemine göre belirgin bir şekilde daha yüksek olduğu başarısız ve başarısız olmayan insan miyokardiyumuna çevrildi (45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 hücre/mg, p < 0.05). Özellikle sunulan protokol ile makul sayıda insan kardiyomiyositini (9-200 hücre/mg) az miktarda dokudan (<50 mg) izole etmek mümkündür. Bu nedenle, yöntem hem insan hem de hayvan kalplerinden sağlıklı ve başarısız miyokardiçin geçerlidir. Ayrıca, soğuk kardiyoplejik solüsyonda 36 saate kadar saklanan insan doku örneklerinden uyarılabilir ve kontraktil miyositleri izole etmek mümkündür ve bu yöntem, yerinde kalp ameliyatı olmayan kurumlardaki laboratuvarlar için özellikle yararlı hale getirilmektedir.
Introduction
Kardiyomiyosit fizyolojisi içine önemli anlayışlar için yol açtı bir seminal tekniği bozulmamış kalplerden yaşayan ventriküler kardiyomiyositizolasyonolduğunu 1. İzole kardiyomiyositler normal hücresel yapı ve fonksiyon, ya da in vivo deneylerin sonuçlarını incelemek için kullanılabilir; örneğin, kardiyak hastalığın hayvan modellerinde hücresel elektrofizyoloji veya uyarma-daralma kaplin değişiklikleri değerlendirmek için. Ayrıca, izole kardiyomiyositler hücre kültürü, farmakolojik müdahaleler, gen transferi, doku mühendisliği ve diğer birçok uygulama için kullanılabilir. Bu nedenle, kardiyomiyosit izolasyonu için etkili yöntemler temel ve çevirisel kardiyak araştırmalar için temel değere dayanır.
Kemirgenler gibi küçük memelilerden ve domuz lar veya köpekler gibi daha büyük memelilerden gelen kardiyomiyositler, genellikle kalbin koroner perfüzyonu ile ham kollajenler ve/veya proteazlar içeren çözeltiler ile izole edilir. Bu kardiyomiyosit izolasyoniçin “altın standart” yöntemi olarak tarif edilmiştir, canlı hücrelerin% 70’e kadar verimleri sonuçlanan2. Yaklaşım aynı zamanda kabul edilebilir kardiyomiyosit verimleri 33sonuçlanan,insan kalpleri ile kullanılmıştır ,4,5. Ancak, koroner perfüzyon sadece sağlam kalp veya koroner arter dalı içeren büyük bir miyokardkin kama mevcut olduğunda mümkün olduğundan, çoğu insan kardiyak örnekleri küçük boyutu ve uygun vaskülatür eksikliği nedeniyle bu yaklaşım için uygun değildir. Bu nedenle, insan kardiyomiyositizolasyon zordur.
İnsan miyokardiyal örnekler çoğunlukla değişken boyutta doku parçaları oluşur (yaklaşık 0.5 x 0.5 x 0.5 cm için 2 x 2 x 2 cm), endomiyokardiyal biyopsiler ile elde6, septal miektomiler7, VAD implantasyonları8, veya eksplant kalpler9. Kardiyomiyosit izolasyonu için en yaygın prosedürler makas veya neşter kullanarak doku kıyma ile başlar. Hücre-hücre temasları daha sonra kalsiyumsuz veya düşük kalsiyum tamponlar daldırma tarafından bozulur. Bunu, proteazlar (örneğin, tripsin), kollajenaz, hyaluronidaz veya elastaz gibi ham enzim ekstreleri veya saflaştırılmış enzimler ile birden fazla sindirim adımı takip eder ve bu da ekstrasellüler matriksin parçalanması ve kardiyomiyositlerin serbestleşmesiile sonuçlanır. Son, kritik bir adımda, fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu dikkatle restore edilmelidir, ya da hücresel hasar kalsiyum-paradoks10nedeniyle oluşabilir,11,12. Bu izolasyon yaklaşımı kullanışlıdır ancak genellikle verimsizdir. Örneğin, bir çalışmada yaklaşık 1 g miyokardiyal doku sonraki deneyler için uygun kardiyomiyosit yeterli sayıda elde etmek için gerekli olduğunu bulundu13. Düşük verim için olası bir nedeni doku kıyma nispeten sert bir yöntemdir. Bu miyositler enzimatik sindirim tarafından serbest olma olasılığı en yüksek olmasına rağmen bu özellikle yığın kenarlarında bulunan kardiyomiyositler zarar verebilir.
İnsan örneklerinden elde edilen hücrelerin izolasyon verimliliğini ve kalitesini etkileyebilecek bir diğer husus da doku iskemi süresidir. Çoğu protokol, iyi sonuçlar için bir ön koşul olarak laboratuvara kısa ulaşım süreleri söz. Bu, insan ventriküler kardiyomiyositlerin çalışmasını yakındaki kalp cerrahisi tesisleri olan laboratuvarlarla sınırlandırmaktadır. Birlikte, bu kısıtlamalar insan kardiyomiyositlerde hayvan modellerinden elde edilen önemli bulguların doğrulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, düşük miktarda dokudan yüksek kardiyomiyosit verimi sağlayan, tercihen uzun taşıma sürelerinden sonra ciddi hasar olmadan geliştirilmiş izolasyon protokolleri tercih edilir.
Burada açıklanan bir vibratom14,,15ile oluşturulan ince miyokard doku dilimleri enzimatik sindirim dayalı bir izolasyon protokolüdür. Doku dilimlerinden izolasyonun makasla doğrama dan çok daha verimli olduğunu gösteriyoruz. Açıklanan yöntem sadece miyokard dokusunun küçük miktarlarda canlı insan kardiyomiyosityüksek verimleri için izin verir ama aynı zamanda depolanan veya soğuk kardiyoplejik çözelti taşınan örnekler için de geçerlidir 36 saat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaşayan kardiyomiyositlerin izolasyonu 40 yıldan daha uzun bir süre önce kurulmuş ve kardiyak araştırmalarda birçok deneysel yaklaşım için ön koşul olmasına rağmen, öngörülemeyen sonuçları olan zor bir teknik olmaya devam etmektedir. Enzim çözeltisi ile koroner arterlerin perfüzyon yoluyla kardiyomiyosit izolasyon yaygın küçük hayvanların kalpleri için kullanılan ve canlı hücrelerin çok sayıda verimleri. Ancak, bu nispeten karmaşık bir sistem ve uzmanlık gerektirir. Ayrıca, çoğu in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Walter-Brendel Deneysel Tıp Merkezi, LMU Münih’ten Andreas Dendorfer’e dilimleme protokolüile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. İnsan miyokardiyal doku örnekleri sağlamak için Kalp Cerrahisi Bölümü’nden Gazali Minabari ve Christian Heim’a, Erlangen Üniversitesi Hastanesi’nden, Erlangen Üniversitesi’nden Hendrik Milting’e, Erich & Hanna Klessmann Enstitüsü’nden Hendrik Milting’e, Ruhr-Üniversitesi Bochum’a ve Erlangen Üniversitesi Hastanesi Çocuk Kardiyoloji Bölümü’nden Muhannad Alkassar’a teşekkür ederiz. Akış sitometrisi desteği için Simon Völkl’e ve Çeviri Araştırma Merkezi’nden (TRC), Erlangen Üniversitesi Hastanesi’nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Ayrıca, Hücresel ve Moleküler Fizyoloji Erlangen Enstitüsü’nden Lorenz McCargo ve Celine Grüninger’e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Üniversitesi Hastanesi’ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) ve Universitätsbund Erlangen-Nürnberg tarafından DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
References
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
- Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
- Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
- Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
- Trube, G., Sakmann, B., Neher, E. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. , 69-76 (1983).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
- Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
- Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
- Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
- Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
- Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
- Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
- Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
- Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
- Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
- Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), 622-633 (1992).
- Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
- Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
- Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
- Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
- Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
- Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
- Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
- Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
- Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E., Pierce, G. N., Claycomb, W. C. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. , 195-198 (1997).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).
