Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

Summary

Presentert er en protokoll for isolering av menneskelige og animalske ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver. Høye utbytter av kalsiumtolerante celler (opptil 200 celler/mg) kan oppnås fra små mengder vev (<50 mg). Protokollen gjelder for myokardium utsatt for kald iskemi i opptil 36 timer.

Abstract

Isolering av ventrikulære hjerte myocytter fra dyre- og menneskehjerter er en grunnleggende metode i hjerteforskning. Dyr kardiomyocytter er ofte isolert av koronar perfusjon med fordøyelsesenzymer. Imidlertid er det utfordrende å isolere menneskelige kardiomyocytter fordi menneskelige myokardprøver vanligvis ikke tillater koronar perfusjon, og alternative isolasjonsprotokoller resulterer i dårlige utbytter av levedyktige celler. I tillegg er menneskelige myokardprøver sjeldne og bare regelmessig tilgjengelige på institusjoner med hjertekirurgi på stedet. Dette hindrer oversettelsen av funn fra dyr til menneskelige kardiomyocytter. Beskrevet her er en pålitelig protokoll som muliggjør effektiv isolering av ventrikulære myocytter fra humant og dyr myokardi. For å øke overflate-til-volum-forholdet samtidig som celleskade minimeres, genereres myokardvevsskiver 300 μm tykke fra myokardprøver med vibratom. Vevskiver fordøyes deretter med protease og kollagenase. Rotte myokardi ble brukt til å etablere protokollen og kvantifisere utbytter av levedyktige, kalsiumtolerante myocytter ved strømningscytokometrisk celletelling. Sammenligning med den brukte vev-chunk metoden viste betydelig høyere utbytter av stangformede kardiomyocytter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollen ble oversatt til sviktende og ikke-sviktende humant myokardi, hvor utbyttene var like som i rotte myokardi og igjen markert høyere enn med vev-chunk-metoden (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 celler / mg, p < 0,05). Spesielt, med protokollen presentert er det mulig å isolere rimelige antall levedyktige menneskelige kardiomyocytter (9-200 celler / mg) fra minimale mengder vev (<50 mg). Dermed er metoden gjelder for sunn og sviktende myokardi fra både menneskelige og dyrehjerter. Videre er det mulig å isolere spennende og kontraktile myocytter fra menneskelige vevsprøver lagret i opptil 36 timer i kald kardioplegisk løsning, noe som gjør metoden spesielt nyttig for laboratorier ved institusjoner uten hjertekirurgi på stedet.

Introduction

En banebrytende teknikk som har banet vei til viktig innsikt i kardiomyocyte fysiologi er isolering av levende ventrikulære kardiomyocytter fra intakte^{hjerter 1}. Isolerte kardiomyocytter kan brukes til å studere normal cellulær struktur og funksjon, eller konsekvensene av in vivo eksperimenter; for eksempel, for å vurdere endringer i cellulær elektrofysiologi eller eksitasjon-sammentrekning kobling i dyremodeller av hjertesykdom. I tillegg kan isolerte kardiomyocytter brukes til cellekultur, farmakologiske inngrep, genoverføring, vevsteknikk og mange andre applikasjoner. Derfor er effektive metoder for kardiomyocyte isolasjon av grunnleggende verdi til grunnleggende og translasjonell hjerteforskning.

Kardiomyocytter fra små pattedyr, som gnagere, og fra større pattedyr, som griser eller hunder, er vanligvis isolert av koronar perfusjon av hjertet med løsninger som inneholder rå kollagenaser og / eller proteaser. Dette har blitt beskrevet som “gullstandard” -metoden for kardiomyocyteisolasjon, noe som resulterer i utbytter på opptil 70% av levedyktige celler². Tilnærmingen har også blitt brukt med menneskelige hjerter, noe som resulterer i akseptable kardiomyocytter^{gir 3,4,5}. Men fordi koronar perfusjon bare er mulig hvis det intakte hjertet eller en stor myokardkile som inneholder en koronargren er tilgjengelig, er de fleste menneskelige hjerteprøver ikke egnet for denne tilnærmingen på grunn av deres lille størrelse og mangel på passende vaskulatur. Derfor er isolering av menneskelige kardiomyocytter utfordrende.

Humane myokardprøver består for det meste av vevsbiter av variabel størrelse (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm til 2 x 2 x 2 cm), oppnådd gjennom endomyocardial^{biopsier 6}, septal myectomies^7,VAD implantasjoner⁸, eller fra utvåte hjerter⁹. De vanligste prosedyrene for kardiomyocyte isolasjon starter med å hakke vevet ved hjelp av saks eller en skalpell. Celle-til-celle-kontakter blir deretter forstyrret av nedsenking i kalsiumfrie eller lavkalsiumbuffere. Dette etterfølges av flere fordøyelsestrinn med rå enzymekstrakter eller rensede enzymer som proteaser (f.eks. trypsin), kollagnase, hyaluronidase eller elaastase, noe som resulterer i en oppløsning av den ekstracellulære matrisen og frigjøringen av kardiomyocytter. I et siste, kritisk trinn må en fysiologisk kalsiumkonsentrasjon gjenopprettes nøye, eller cellulær skade kan oppstå på grunn av kalsiumparadokset^10,11,12. Denne isolasjontilnærmingen er praktisk, men vanligvis ineffektiv. For eksempel fant en studie at nesten 1 g myokardvev var nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig antall kardiomyocytter egnet for påfølgende eksperimenter¹³. En mulig årsak til lave utbytter er den relativt harde metoden for å hakke vevet. Dette kan spesielt skade kardiomyocytter som ligger på chunk kantene selv om disse myocytter er mest sannsynlig å bli utgitt av enzymatisk fordøyelse.

Et annet aspekt som kan påvirke isolasjonseffektivitet og kvalitet på celler hentet fra menneskelige prøver er varigheten av vevsiskemi. De fleste protokoller nevner korte transporttider til laboratoriet som en forutsetning for gode resultater. Dette begrenser studiet av menneskelige ventrikulære kardiomyocytter til laboratorier med nærliggende hjertekirurgi fasiliteter. Sammen hindrer disse restriksjonene verifiseringen av viktige funn fra dyremodeller i menneskelige kardiomyocytter. Forbedrede isolasjonsprotokoller som tillater høye kardiomyocytteravlinger fra små mengder vev, helst uten alvorlig skade etter lengre transporttider, er derfor ønskelig.

Beskrevet her er en isolasjonsprotokoll basert på enzymatisk fordøyelse av tynne myokardvevskiver generert med en vibratom^14,15. Vi viser at isolasjon fra vevskiver er mye mer effektiv enn det fra vevsbiter hakket med saks. Den beskrevne metoden gir ikke bare mulighet for høye utbytter av levedyktige menneskelige kardiomyocytter fra små mengder myokardvev, men gjelder også for prøver lagret eller transportert i kald kardioplegisk løsning i opptil 36 timer.

Protocol

Alle eksperimenter med rotter ble godkjent av Dyreomsorgs- og brukskomiteen Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Innsamling og bruk av menneskelige hjertevevsprøver ble godkjent av institusjonelle gjennomgangsråd ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Ruhr-Universitetet Bochum. Studier ble utført i henhold til Helsinkis retningslinjer. Pasientene ga sitt skriftlige informerte samtykke før vevsinnsamling. Hunnrotter (150–200 g) ble kommersielt oppnådd, bedøvet ved å injisere 100 mg/kg t…

Representative Results

For å verifisere isolasjonseffektiviteten ble protokollen brukt med rotte myokardi, og det resulterende antallet levedyktige myocytter ble sammenlignet med tallene oppnådd ved isolasjon via koronar perfusjon og ved isolasjon fra små vevsbiter (delisolasjon, Figur 2). Chunk isolasjon og isolasjon fra vevskiver ble utført fra de samme hjertene. For isolasjon via koronar perfusjon ble imidlertid hele hjertet brukt. Koronar perfusjon ga overveiende stangformede og kryss-striated kardiomyocyt…

Discussion

Selv om isolering av levende kardiomyocytter ble etablert for mer enn 40 år siden og fortsatt er en forutsetning for mange eksperimentelle tilnærminger i hjerteforskning, er det fortsatt en vanskelig teknikk med uforutsigbare resultater. Kardiomyocyte isolasjon via perfusjon av koronararteriene med enzymløsning brukes ofte til hjerter av små dyr og gir et stort antall levedyktige celler. Dette krever imidlertid et relativt komplekst system og kompetanse. Videre er de fleste menneskelige vevsprøver ikke egnet for den…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection