אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית
Summary
מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.
Abstract
הדמיה תאי בטא הוא צעד מפתח לקראת הבנת השתלת איון. למרות פלטפורמות הדמיה שונות להקלטה של ביולוגיה תא בטא פותחו ומנוצלים vivo, הם מוגבלים במונחים של מתן רזולוציה תא יחיד והקלטות אורכיות רציפות. בגלל השקיפות של הקרנית, התא הקדמי של העין (ACE) בעכברים מתאים היטב ללמוד ביולוגיה של תאי אי הלבלב האנושי והעכבר. הנה תיאור של איך גישה זו יכולה לשמש לביצוע הקלטות אורכיות רציפות של השתלה ו revascularization של שתלים בודדים איון אנושי. שתלי אייון אנושיים מוכנסים לתוך ACE, באמצעות NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4–Rag2-/- עכבריםנממענים. הדבר מאפשר חקירה של הרחבת תאי הנמען לעומת תאי התורם ותרומתם של תאי הנמען בקידום האנקפולציה וסקולריזציה של השתל. יתר על כן, גישה שלב אחר שלב לניתוח תמונה וכמת של נפח האי או כלי דם מחולקים וקפסולת איון ויוצרים תאים נמען מתואר.
Introduction
סוכרת מתאר קבוצה של מחלות מטבוליות המאופיינת ברמות גבוהות של גלוקוז בדם כתוצאה של ייצור אינסולין לא מספיק מאובדן או תפקוד לקוי של תאי ביתא איון הלבלב, לעתים קרובות מלווה תנגודת לאינסולין. סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D) הן מחלות מורכבות שבהן התפקוד הפרוגרסיבי של תאי הביתא גורם להתפתחות מחלות. T1D הוא זירז על ידי התקפה אוטואימונית על תאי בטא, בעוד T2D נחשב מונע על ידי גורמים מטבוליים, אם כי עם ראיות גוברות של דלקת מערכתית בדרגה נמוכה1. השתלת איונים אנושיים תורמים, במיוחד לחולים T1D, מציע את הפוטנציאל לספק שליטה גליקמית פיזיולוגית. עם זאת, מחסור של תורמי רקמות וחינוך איון עני מנע השתלת איון להפוך לאפוביה טיפולית הזרם המרכזי. חלק ניכר של שתל האי הפונקציונלי אובד בתקופה שלאחר השתלה מיידית (24-48 שעות) בשל הסביבה המארח היפוקסית, דלקתית, אימונוגנית2,,3. כדי להעריך את היעילות של שיטות התערבות לשיפור הישרדות איון, ניטור מתמשך של השתלות כאלה הוא הכרחי.
בטכניקות vivo כדי למצוא את גורלם של איונים הלבלב האנושי מושתלים לאחר השתלה עדיין נשאר אתגר עבור סוכרת מחקר4,5. עד כה, טכניקות הדמיה לא פולשניות, כולל טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), או אולטרסאונד (ארה”ב) להראות פוטנציאל לכמת והערכה פונקציונלית של איים מושתלים בתנאיםניסיוניים 5. עם זאת, בהתחשב בגדלים הקטנים של איון, מדידות כמותיות על ידי אותם מודאליות סובלות מרזולוציה לא מספקת. התא הקדמי של העין (ACE) כאתר השתלה לתצפית הוא פתרון הדמיה מבטיח שאינו פולשני המציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ביעילות וניטור תכופים על פני תקופותארוכות 6. שיטה זו נוצלה בהצלחה כדי ללמוד ביולוגיה איון העכבר (נבדק ביאנג ואח‘. 7), תגובות חיסוניותאוטואימוניות 8, כמו גםהשתלת איוןאנושי 9,10.
כאן שיטת השתלת ACE משולבת עם גישה 2-פוטן הדמיה לחקור את הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי הלבלב engraftment על ידי הקלטות רציפות וחוזרות על עצמן על שתלי אי בודדים עד 10 חודשים לאחר ההשתלה. תכונות הדמיה multiphoton של עומקי הדמיה גדולים יותר והפחתת פוטו-בליך הכולל ונזק לצילום להתגבר על מגבלות ההדמיה של מיקרוסקופ confocal11. כימות של הדמיית פלורסנט כרוכה במספר שלבים, כולל הכנת מדגם איון, השתלת איון, רכישת תמונה, סינון תמונות להסרת רעש איון או רקע, פילוח, כימות וניתוח נתונים. השלב המאתגר ביותר הוא בדרך כלל חלוקה למחיצות או פילוח של תמונה לחלקים או לאזורים מרובים. הדבר עשוי לכלול הפרדת אות מרעש רקע, או אזורי קיבוץ באשכולות של voxels בהתבסס על קווי דמיון בצבע או צורה כדי לזהות ולתייג voxels של אמצעי אחסון תלת-מית-מיוידי המייצג כלי דם של איון, לדוגמה. לאחר המקטע, סטטיסטיקה כגון גדלי אמצעי אחסון של אובייקט היא בדרך כלל פשוטה לחילוץ. מסופקת שיטה לכמת ולחילוץ של נתוני ההדמיה, כגון פילוח ופריט חזותי של נתונים. תשומת לב מיוחדת משולמת להסרת autofluorescence איונים אנושיים והבחנה בין כלי דם איון כמוסה איון ויוצרים תאים נמען.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה מוצגת כדי לחקור את תהליך השתלת תאי איון הלבלב האנושי על ידי התבוננות המעורבות של הנמען ורקמות התורם. לאחר ניתוח פולשני מינימלי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של עין עכבר immunodeficient, העכבר מתאושש במהירות בתוך דקות לאחר הניתוח. ההליך מתבצע בעין אחת. בדרך כלל, מ 5-7 ימים לאחר השתלה ואילך…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השבדית, אזור המחקר האסטרטגי Exodiab, Dnr 2009-1039, הקרן השוודית למחקר אסטרטגי Dnr IRC15-0067 לLUDC-IRC, האגודה הפיזיוגרפית המלכותית בלונד, סוכרת ו Barndiabetesförbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
